この作品は、医歯薬学総合研究のバロウズウェルカムのキャリア賞（AKM）、ホワイトホール財団研究助成（AKM）、スローン財団フェローシップ（AKM）、NIH EY019277（AKM）、および資金NEI、ビジョントレーニンググラント、EY013319（によってサポートされていましたEAK）。

<ol><li>二光子顕微鏡、ニューロンが蛍光マーカーで標識されている準備を使用して無傷の脳内の神経細胞を可視化するために使用されます。実験で我々は層5錐体細胞には1をラベルする GFP - Mトランスジェニックマウスのラインを使用するここで紹介。層5錐体細胞は、PIAのレベル以下に300μmの深さに樹状突起と樹状突起棘の可視化を可能に、浅層に樹状突起を投影。代替アプローチは、ウイルスマーカーを用いて細胞を（ らロウェリーを参照してください。、Joveのために提出された）ラベルを付けることです。 </li><li>無菌手術のために70％エタノールおよびオートクレーブのツールを使用してワークスペースを滅菌する。きれいなドレッシングを使用してオペレーティング表面を覆う。 </li><li> IACUC承認された手順を使用してAVERTINの四半期投与量（0.0075 mg / ml）を、続いフェンタニルカクテル（metatomadinは0.5 mg / kg体重;ミダゾラム5 mg / kgのフェンタニル0.05 mg / kg体重）をマウスに麻酔。鎮痛剤をマウスに前処理、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を（SQ）皮下投与。テール/つま先ピンチに反応をテストすることによって、麻酔薬平面のレベルを監視します。 </li><li> 37.5で動物を維持° C添付の直腸温度計で加熱毛布を用いた。 </li><li>乾燥から目を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。手術中に、光源から目を保護するために紙の小さなシートとフードの目。 </li><li>はさみを使って、目に頭の後ろ（耳の後ろ）から髪を削除する。 </li><li> 70％エタノールのシーケンシャルアプリケーションと動物の頭の上をきれいに、betadineスクラブとbetadineの溶液を加えた。 </li><li>眼への正中線（イメージ化される半球に応じて）の右側または左側に沿って耳と、最大の後ろにL -カットの切開を行います。手術部位から皮膚を倍以上との距離。皮膚がイメージングセッションは、次縫合されるため、皮膚を削除しないでください。 </li><li>微細な鉗子を使用すると、静かに関心のある分野から持ち上げ、皮膚を引っ張る。 </li><li>優しく清潔なピンセットや顕微ブレードと頭蓋骨の露出面積から骨膜を削り取る。綿棒を使用して、完全に骨膜メンブレンを乾燥させると、それは完全に削除されていることを保証するために頭蓋骨に10％塩化第二鉄を少量。頭蓋骨は（11を参照）接着剤の適切な付着を確保するために、完全に乾燥していることが重要です。鉗子または顕微ブレードを使用して、静かに乾燥させ骨膜の膜をこすり落とす。 </li><li>ステンレス鋼のヘッドプレート（図1を参照）し、印を押さなけれ頭蓋骨にプレートのイメージングのウィンドウ周りシアノアクリレート接着剤の薄層を適用します。 </li><li>綿綿棒の棒の木の端を使用して、画像ウィンドウの内側の縫い目に接着剤を適用し、イメージングプレートと頭蓋骨の曲率の間のすべてのギャップを埋めることを確認すること。 </li><li>ウィンドウに接着剤のアクセラレータのドロップを置きます。すぐにワイプ綿棒または金と過剰な接着剤のアクセラレータを拭き取る。接着剤は完全に掘削する前に固化してください。 </li><li> 0.7ミリメートルのステンレス鋼ばりを貼付歯科用ドリルを用いた撮像ウィンドウで頭蓋骨を薄くし始める。 0.9％滅菌生理食塩水の臨時のアプリケーションで代替掘削は頭蓋骨上にあまりにも多くの熱を生成しないように。 </li><li>歯科用ドリルで頭蓋骨の表面全体に小さなストロークを使用して頭蓋骨上に薄いの4x4 mmのウィンドウ。平滑末端の鉗子で頭蓋骨の薄さをテストします。頭蓋骨の表面は穏やかな圧力をわずかにインデントされます。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。 </li><li>頭蓋骨が薄いと、すべての破片を掃除窓の場合は、頭蓋骨に生理食塩水を置きます。解剖スコープに取り付けられたデジタルカメラとイメージングのウィンドウを撮影。脳血管系の写真と使用は、その後のイメージングセッションのためにイメージングプレートを配置する位置を見つけるのに役立ちます。 </li><li> 2光子リグに動物を輸送しています。動物全体のイメージングセッション中に加熱毛布（直腸プローブ付き）にままにしてください。注：鎮静下にある間、動物の体温は、皮質損傷または場合によっては死に至る加熱装置のない状態で大きく変動します。 </li><li>マイタイレーザー、最大電力および変更されたオリンパスFluoview共焦点ユニット用10Wソリッドステートポンプを使用した2光子顕微鏡が使用されます。システムは、脳からの蛍光の最大の検出を可能にするために可能な限り客観的に近いとしてインストールされている深部組織のイメージングと外部検出器に最適化されています。オリンパスLUMPlan FL / IR 20X/0.95NAの対物レンズが使用されます。 0.9％生理食塩水は、客観的な浸水のための画像処理時に使用されます。 </li><li>明るく標識したニューロンを含む領域を識別するこの顕微鏡を使用して、低デジタルズーム（× 1）。 </li><li>顕微鏡の接眼部に固定されたデジタルカメラを使用して、撮像領域の写真を撮る。また、血液の血管パターンの概略を述べる。これは、再することが必要ですその後の時点で同一の撮像位置に回します。 </li><li>樹枝状分岐の程度を示す脳の全体の可視範囲（通常は〜200μmをスパニング）を介して、低倍率のスタック（5μmのステップX20の目標、512 × 512ピクセル）を取得。注：この低倍率の画像は、血管や樹状突起の両方が若く、成熟した動物で、その構造を維持するとして、その後の時点でのイメージング領域を見つけるために使用されます。 </li><li>イメージングソフトウェア（Fluoview、V. 5.0、FV300）を使用して、8倍デジタル倍率を増加させる。 X、Y座標（パン座標）を必要に応じて調整し、場所と樹状突起棘の構造を含む、詳細な樹枝状形態が表示されます高倍率のスタックを収集する。各スタックコレクション、すなわちパン座標、コレクション、Z -ステップサイズおよびスタック内のステップ数の範囲についての詳細なメモを取る。その後の時点で、この樹状突起や軸索に戻るときにこれらのノートは使用されます。 </li><li>イメージングの後、静かに頭蓋骨の表面から板を分離することにより、ヘッドプレートを取り外します。鉗子を使用して、頭蓋骨に残った残留接着剤を除去し、0.9％滅菌生理食塩水で頭蓋骨の表面を拭いてください。 ＃6の縫合糸を使用して一緒に頭蓋骨を介して皮膚を縫合。 70％エタノールでエリアを拭いてください。手術後の回復中に痛みを軽減するために、0.1 mg / kgのブプレノルフィンの鎮痛、SQを管理する。 </li><li>それが起動して、モバイルになるまで加熱ランプの下できれいなケージで動物を置きます。オリジナルのケージに動物を返します。 </li><li>後の時点でのイメージを再作成の動物（私たちの撮影時間のポイントが離れて2日から何ヶ月にどこでも構いません）に、ステッチを削除するか、上記のような無菌の方法を使って頭の上に皮膚を再び開きます。元画像の場所を見つけるために脳血管系（最初の手術の日に撮影）のデジタル画像を使用してください。 Reaffixステンレス鋼headplate（ステップ10-12）。撮影時間の点の間に再成長している可能性のある骨離れて静かに薄いために顕微ブレードを使用してください。歯科用ドリルで薄い、必要に応じて。明確なイメージング破片のウィンドウと0.9％滅菌生理食塩水の滴を適用する。 </li><li>二光子顕微鏡に動物を運ぶと、元画像のフィールドを探します。援助のための最初のイメージングセッション中に撮影されたデジタル写真を使用してください。 </li><li> Fluoviewプログラムを開き、元の低倍率の画像を開きます。貼って、コンピュータの画面に透明シートや透明性のペンを使用して主要な血管のパターンをスケッチ。 </li><li>ライブ画像を開いて、透明フィルム上にスケッチパターンへの血液の血管系を再調整してください。 </li><li>構造にズームイン8倍速のイメージを再作成するには、以前のイメージングセッションから目的収集したスタックを開く。コンピュータの画面に貼付透明フィルム上に構造を（グリア、樹状突起、軸索すなわち）、スケッチ。 </li><li>ライブイメージから8倍速でのズームとパンを設定するには、初日のイメージングパラメータに変換します。低倍率の位置を揃えるの精度に応じて、それはまた、若干画像の角度を調整する必要があります。所望の構造が発見されると、あなたのスケッチ高倍率のパターンに構造を一致させる。その後の分析のためのZスタック画像の同一のステップの大きさと数でz -スタックを収集する。 </li><li>すべての高倍率の画像が再収集されるまで、手順29と30を繰り返します。 </li><li>イメージングが完了したら、手順22から24を繰り返します。再イメージングは​​、2つの独立した時点にでまで繰り返すことができる。 </li><li>動物実験は、実験動物のケアの評価と認定のために協会が完全な認定で、医学と歯学のロチェスター大学大学の実験動物医学のビバリウムと部門が定めたガイドラインと規則に従って行われた州法、連邦法及びNIHのポリシーに準拠して国際的な（AAALAC）となります。 </li></ol>代表的な結果 GFP - M発現マウスでは、層5錐体細胞とそれに対応する樹状突起のサブセットは容易に2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）1を用いて可視化することができます。ここでは、目的の画像の位置上の頭蓋骨が〜10から30ミクロンまで薄くされている間伐-頭蓋骨の準備を示した。正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちは明らかに急性または慢性の分析（図2）のための完全な視覚野における皮質の樹状突起と棘を可視化することができました。 <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。カスタムヘッドとベースプレート。間伐-頭蓋骨の手術の準備のために使用されるカスタムメイドのヘッドとベース板の（）上から見た図。カスタムメイドの頭部と底板の（B）は側面図。 （C、D）ヘッドプレートの詳細な回路図と画像。 <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="図2" /> <stroNG&gt;図2。薄い頭蓋骨の準備以下の2PLSMから代表的な結果。（）二光子顕微鏡を用いてトランスジェニックGFP - Mのマウスの視覚野でのin vivoで画像化樹状突起。画像は175μmの最終的な深さにPIAからすべての5μmを得られる単一のイメージの投影です。の箱入りのエリアは、（B）と（C）0日目に結像（D0）と4日後（D4）の拡大された領域を表します。安定した棘（白い矢印の頭を）実証BとCの箱入り樹状分岐の（D、E）高倍率では、/後退の棘（赤い矢印の頭）と新しい​​の棘（緑の矢印の頭を）失った。スケールバーは= Aは200μm、B、Cの20μmの、D、E.は5μm。

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

二光子顕微鏡を用いて慢性的なイメージングは、可塑性2-5時にトリガーの形態学的変化を研究するためにますます一般的な手法になりつつあります。ここでは、異なる画像間で無傷のマウス脳内の識別された樹状突起に従うことを間伐-頭蓋骨の準備を示しています。このプロトコルでは、頭蓋骨は皮質への最小限の損傷を引き起こし、脳の機能6を変える可能性の神経炎症の?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

二光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いた in vivoイメージングでは無傷の脳で生きている細胞と神経突起の研究ができます。ここで紹介するテクニックは、中枢神経系におけるシナプス後興奮部位の大部分を表す小さな構造である樹状突起の追跡を可能にする顕微鏡の分解能を持ついくつかの時点（慢性の画像）で脳の同じ領域のイメージングを可能にします。明らかにいくつかの時点では問題なく皮質の構造を解決するためには、シナプスと回路のリモデリングにおける形態学的変化は、根本的なメカニズムを説明することがする脳の可塑性の研究では特に、多くの利点があります。このビデオと補助材料では、我々は、間伐、頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳のin vivoイメージング慢性ためのプロトコルを示す。間伐-頭蓋骨の準備は、このように炎症反応の発症を減らすこと、硬膜および/または皮質が損傷する可能性を回避する低侵襲アプローチ、である。このプロトコルが正しく実行されると、それは明らかに長期間にわたって無傷の脳内の樹状突起棘の特性の変化を監視することが可能です。

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す<em&gt; in vivoで</em間伐-頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳の&gt;イメージング。

間伐-頭蓋骨の準備を使用してマウス視覚野の慢性的イメージング

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  University of Rochester. このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す in vivoでイメージング。

ビデオ: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

神経科学

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

ための間引き頭蓋骨皮質ウィンドウ·テクニック<emインビボで&gt;</em&gt;光干渉断層イメージング

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

ハイフィールドのfMRIを使って大人の猫における聴覚皮質の機能イメージング

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

拡散テンソルイメージングとラクトを用いたヒト色素欠乏症における一次視覚経路で接続を測定します

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

ラットの慢性移植のための末梢神経刺激電極の調製

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...