著者は、彼の技術支援や動物の世話のためにアンドリューJダン、私たちの研究室で優秀な学部研究生を、感謝したいと思います。健康補助金HD058834とミズーリ州のライフサイエンスフェローシップの大学の研究所では、この作業に資金を供給した。

手術前の楽器/材料<ul><li>ワイヤーカッター/プライヤー</li><li>ガーゼ2 × 2&quot;パッド</li><li>暖房パッド</li><li>硝酸銀棒</li><li>無菌手術用手袋</li><li>イソフルラン吸入麻酔薬</li><li>クロルヘキシジングルコン酸4％（防腐剤手術スクラブ） </li><li>無菌の2から0外科鋼の縫合</li><li> 25 × 5 / 8ゲージの針（オートクレーブ） </li><li>止血鉗子（オートクレーブ） </li><li>外科用鋼製縫合糸</li></ul>手術の手順<ol><li>滅菌フィールドを作成します。滅菌の手順に従ってください。 </li><li> 2マウスを麻酔 - イソフルラン3％。 </li><li>加熱パッド上でマウスを置きます。 </li><li>クロルヘキシジン溶液を尾をスクラブ。 </li><li>ケート5、6、または7 番目の椎間腔（尾の2つの骨の突起の間に、尾の基部に、体毛の終わりからカウントを開始）。 </li><li>椎間腔に、二つの椎骨の間にパイロットホールを作るために止血剤と25G針を使用してください。 </li><li>長さ10cm鋼製縫合糸を切断するワイヤカッターを使用してください。 </li><li>針を外し、テールのどちらかの端に、穴を通して縫合糸の5 cmのスチールの縫合糸を挿入します。 </li><li>尾の各側面には、縫合糸の+ 5 cmの必要があります。 </li><li>テールの上に親指の先端を置きます。 </li><li>空いている手を使用し、親指の先端に鋼製縫合糸を巻き、大きなループを形成するために両端をねじります。傷または円形の部分は+ 3 mm長でなければなりません。 </li><li>親指を削除します。 </li><li>止血鉗子で縫合糸の一方の鎖をクランプし、小さなループにそれを曲げる、の最後はオリジナルの大型ル​​ープ上のねじれにできる限り近い添付されます。 </li><li>余分なワイヤーを切断し、そしてツイスト線を後ろに曲げる。 </li><li>余分な出血がある場合は、硝酸銀の棒でそれを停止することができます。 </li><li>前後肢のアンロードに5-7日間回復するために、単一の家のケージにイソフルランと場所でマウスの電源を切ります。複数のマウスが一緒に収容されている場合、テールのリングが絡み合ったなる。 </li></ol> 1。後肢アンロードの手順材料<ul><li>サイズ10-24 X 4本のビス、動物ごとに。 </li><li>ナイロンロックナットサイズ10 - 24、動物ごとに。 </li><li>ウィングナットサイズ10 × 24、動物ごとに2つ。 </li><li>ワッシャーのサイズ¼ X 1、動物ごとに2つ。 </li><li>スナップフックサイズ＃6、1-11/16&quot;、と一個の動物との釣りのスイベル。 </li><li>ボビン金属のミシン。ひとつあたりの動物。 </li><li> S字フックの小さなペーパークリップ、動物ごとに</li><li>プライヤー。 </li><li> 2 × 2&quot;ガーゼ。 </li><li> 2&quot;黒の紙のバインダーのクランプ。 </li><li>ダクトテープ/ラボテープ。 </li><li>少しケージの完全な長さを超える1-3/8&quot;メッキマイナス棒鋼</li><li> 50センチメートルX 40センチメートルX 20センチメートルケージ（ラットケージ）。 </li><li>曲がった管と水のボトル。 </li><li>ステンレス鋼線、水のボトルをサポートするために、U字型。 </li></ul>ケージのセットアップ<ol><li>ダクトテープで一時的にダウンして1から38&quot;プレート溝スチールケージの上にバー、およびテープを置く。 </li><li>機械のネジを1ウィングナットをネジ、ワッシャーを挿入し、ネジの谷の溝付き鋼板±ケージの端から15 cmの挿入。 </li><li>別のワッシャーとウィングナットを追加。両方のウィングナットを締めますが、完全にそれが後で調整を行うために必要になるので、締めしないでください。 </li><li>ボビンの中央の穴から機械のネジを挿入します。 </li><li>落下ボビンを防ぐために、機械のネジの端にナイロンロックナットをねじ込みます。ボビンは、自由に回転さしてください。 </li><li>ボビンの下部を通して釣りスイベルからスナップフックを挿入します。 </li><li>クリップからS字状のフックを形成するためにペンチを使用してください。 （フックを形成するためにペーパークリップから2cmをカット）。 </li><li>釣りのスイベルの穴からS字フックの一端を挿入し、ペンチでシャットダウンそれをつまんで。 </li><li>ケージの側面の内側にあるマシンのネジと平行にU字型のワイヤーを、置き、そして完全な水のボトルをサポートするバックエンドを曲げる。 </li><li> spicketが下向きですが、底に触れていないと、U字型ワイヤーに水の入ったペットボトルを挿入します。 </li><li>曲げ2&quot;バインダーは、彼らが近くにシャットダウンしないことができるように、オープンクランプ。それは落ちることなく、その中に食品の3〜4個を保持するだけで十分なテンションが、これは食物を破砕からクランプの力を防ぐ、または弾圧されマウスの鼻。 </li><li>バインダーのクランプに齧歯類固形飼料の4個の場所3。 </li></ol>マウスの後肢のアンロード<ol><li>テールのリングの小さいリングを介してS字状のフックの開放端を挿入します。 </li><li>小ねじの下側ウィングナットを締めたり、緩めて、マウスの高さを調整します。下肢は、体重負荷であってはならない。一度最適な高さは、上翼のナットを締めて実現されます。 </li><li>マウスが後肢でspicketに登ることができないように水のボトル、およびU字型の線の位置を変更。<html>ケージの側面にダクトテープで水のボトルを固定します。 </li><li>マウスがその上に登ることができないようにケージの底の上に食べ物とバインダーのクランプを置き、ダクトテープとテープをダウン。 </li><li>複数の動物が後肢ケージの反対側にアンロードされた場合と同じ手順を繰り返します。ハウスケージごとに2つの動物、宇宙動物を彼らはほとんどお互いに触れることができるように。 </li><li>緩く魚のスイベルにマウスの尾をラップする2 × 2ガーゼを使用してください。尾にガーゼを固定し、ガーゼを包むテープの小片を使用してください。このステップでは、血尾の先端にプーリングし、その尾が壊死になることにつながる、下方に垂下から尾を防ぐために重要です。 </li><li>ケージにcobの寝具の少量を追加。あまりにも多くの寝具そうでなければ、マウスは寝具との試みのマウンドから寝具に後肢をロードする予定を追加しないでください。 </li></ol> 2。代表的な結果： テールリングHUの技術の成功を確立するために、我々は尾輪の手術の前に、と前にとHUと復旧後、動物の体重を測定し、すべてのグループおよび副腎腫瘤、ヒラメ筋の質量。 実験を通して、マウスの体重を図1に示されています。前のテールリング手術（24.7 ± 3.5グラム）にマウスの体重は、HUの前に尾輪の手術（24.3 ± 2.9グラム）からの回復の5日後に有意差は認められなかった。も体重が大幅に、HUの14日間（22.7 ± 1.9グラム）の直後に辞退HUの28日間（21.3 + 2.1グラム）またはHU（24.0 ± 1.8グラム）から3日間の回復後でした。 14および28日間のHUは、体格の小さい（-6.8％と12％）が、非重大な損失をもたらしたが、マウスは完全に回復の3日後にプレHUの体重まで回復した。外来コントロールマウスとHUのマウスの摂餌量を図3に示されています。平均毎日の食物摂取量はコントロールと比較して28日間HUのマウスでは差がなかった。 我々は効果的HUの手順（図2）を示す14および28日（-39.1％、および-46.6％）のためのHU以下のかなりのヒラメ筋の萎縮を観察した。さらに萎縮のこの度はHU 2、7、8の2〜4週間の予想文献値と一致している。 HUヒラメ筋の質量からの回復の3日間に続いて大幅にコントロール値の74％に増加した。回復群のヒラメ筋の質量は、HUの両方のグループよりも有意に大きかったが、外来対照動物よりも、はるかに少ない。 副腎重量は、動物のストレスの指標として測定され、左と右副腎の両方を摘出し、秤量した。平均重量は全群で対照とHUマウスマウス（図4）のための同等であった。 以前にラットで我々は10出ていたHUの先頭に動物の数の成功率はサスペンション装置から出てくることなく、HUを完了した動物数（尾トラクションテープを噛む動物に起因）と比較していることが示されている12のモレ-ホルトンの技法1を使用。この研究ではマウスのなし（N = 54）はこれまでHUの期間の終了前に懸濁液から降りてきていません。我々は、しかし、深刻な炎症を起こして尾を開発したつのマウスを持っていなかった。炎症が明らかになったとき、我々は、炎症部位が治癒するようにテールリングを削除し、その後HUの期間を完了するために別のテールリングを配置。 彼らはサスペンション装置から出てくるので、過去に我々はHUのモレ-ホルトンの方法を使用している時、我々は、通常1〜2匹/群を排除する。トレイルリング方式で誤って14または28日間（nは= 54マウス）のためのHUの期間中、HUの装置から出てくるマウスのないエピソードはありませんでした。 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig1.jpg" alt="図1" /> 図1体重の変化（平均± SD）。略語：CON：荷重制御のマウス（n = 76）、プレHU：前のHUにすべてのマウス（n = 54）、HU14：14日（N = 34）でアンロードしたマウスの後肢、HU28：後肢のためのアンロードマウス28日（N = 20）、REC：ケージに許可されて後肢無負荷時のマウスは、3日（N = 22）のために回復する。体重に有意差はグループ間で観察されなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。ヒラメ筋の萎縮（平均± SD）。略語：CON：荷重制御のマウス（n = 76）、HU14：マウス14日間（N = 34）でアンロード後肢、HU28：後肢が28日（N = 20）でアンロードマウス;とREC：許可されて後肢無負荷マウスケージに3日間（N = 22）のために回復する。 *体重がコントロール（CON）より（P &lt;0.001）に有意差。両方HU群より（P &lt;0.01）δSignificantly異なる。 467fig3.jpg&quot;ALT =&quot;図3&quot;/&gt; 図3。食料消費（平均± SD）。体重がかかると後肢のアンロード時の平均毎日の食事の摂取量（g /日）。略語：荷重制御のマウス（n = 76）、HU：マウス後肢unloaded14 - 28日間。 CONとHUの群間に有意差は認められなかった。 <img src="/files/ftp_upload/2467/2467fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。副腎腫瘤（平均± SD）。略語：CON：荷重制御のマウス（n = 76）、HU14：マウス14日間（N = 34）でアンロード後肢、HU28：後肢が28日（N = 20）でアンロードマウス;とREC：許可されて後肢無負荷マウスケージに3日間（N = 22）のために回復する。有意な差はグループ間で観察されなかった。

<ol>
	<li>Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+method+for+hindlimb+unweighting.">An alternative method for hindlimb unweighting.</a> J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).</li><li>Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+disuse:+a+comparison+of+hindlimb+suspension+and+immobilization.">Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization.</a> J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).</li><li>Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++transients+in+mouse+soleus+muscle+after+hindlimb+unloading+and+reloading.">Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading.</a> Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).</li><li>Morey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+and+bone+turnover:+correlation+with+a+new+rat+model+of+weightlessness.">Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness.</a> BioScience. 29, 168-172 (1979).</li><li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindlimb+unloading+of+growing+rats:+a+model+for+predicting+skeletal+changes+during+space+flight.">Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight.</a> Bone. 22, 83-88 (1998).</li><li>Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindlimb+unloading+rodent+model:+technical+aspects.">Hindlimb unloading rodent model: technical aspects.</a> J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).</li><li>Thomason, D. B., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophy+of+the+soleus+muscle+by+hindlimb+unweighting.">Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting.</a> J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).</li><li>Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+soleus+muscle+myosin+expression+during+hindlimb+suspension+and+recovery.">Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery.</a> J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は非常に成功したと判定さ後肢アンマウスの代わりの方法を、評価した。ここで説明するようにテールリング方式は、長期の後肢懸垂のために使用され、復旧後、HUを検討する。これらの条件のそれぞれの下、安定的な食物摂取、体重、及びマウスの副腎重量によって証明されるように適応するため、障害の証拠はなかった。このテールリングHUの手法は、実行するために簡単で、容易に非​​常に少ない外科診療に組み込むことができます。 伝統的なモレ-ホルトン5、6の方法に比べテールリング方式のいくつかの利点があります。最初に、皮膚とそのテールのリングの移植部位は問題が起こるようなら、それだけではなく一時停止期間の終了時に、すぐに明らかである、常に見える状態です。第二に、動物は、データセット内のマウスかどうかを保持するかどうかの決定を行うために必要がなくなります、HU中いつでもサスペンション装置から取得することはできません。また、マウスはリング装置を気にしない人として、リカバリのHUから解放されるとき、彼らはHU以下のシームレスな回復局面を可能にする、彼らの尾を改ざんしないでください。最後に、テールリング方式と後肢無負荷時のマウスは、モレ-ホルトンテール牽引法によってアンロードしたマウスの後肢よりもより自分の体重を維持する。我々の手ではHUの14日後に我々は、体格の小さい（-6.8％）が非有意な損失を観察した。インガルスらは、モレ-ホルトンの方法3でHUの14日後にマウスの体重が大幅に-12％の縮小が観察されたのに対し。インガルスは副腎重量が報告されていないものの、それは私たちのテールリング方式は、マウス（私たちのHUのマウスにおける副腎重量は対照より異なっていない）と後肢のアンロード期間中の体重のよりよい維持管理にあまりストレスを与えることが表示されます。 要約すると、後肢のアンロードのテールリング法を開発し、14および28日間マウスHUでテスト、およびマウスにHU 3日後のケージ回復に返されました。副腎重量、体重及び食物摂取量に基づいて、マウスは尾リング装置によく適応しているように見えます。テールリング後肢のアンロードの方法は、従来のモレ-ホルトン後肢アンロードテクニックに便利な、簡単な代替手段です。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Wire cutters/pliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ace Hardware </td>
<td>84-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gauze</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-037-901</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sunbeam</td>
<td>Z-1228-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver nitrate applicators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ARZOL</td>
<td>0001-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane,USP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novaplus</td>
<td>NDC 0409-3292-49</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chlorhexidine Gluconate 4%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Purdue Products L.P</td>
<td>NDC 67618-200-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 2-0 surgical steel suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>SS-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 5/8 A gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Terumo</td>
<td>NN 2516R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostat/ needle holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>12500-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Size 10-24 X 4 machine screws</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>90272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nylon lock nut size 10 X 24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>180141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wing nut size 10 X 24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>180243</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fender Washer size &frac14; X 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hillman The Fastener Center</td>
<td>290012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16&#x201D;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bass Pro Shop</td>
<td>38-481-554-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metal sewing machine bobbin.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Singer</td>
<td>45785</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper clip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>221720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2&#x201D; black paper binder clamps.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>308957</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch Multi-Use Duct Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Depot</td>
<td>790710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-3/8&#x201D; Plated slotted steel bar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Home Depot</td>
<td>548932</td>
<td>Extends slightly beyond the full length of the cage</td>
</tr>
<tr>
<td>50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternative Design Manufacturing</td>
<td>RC88D-PC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alternative Design Manufacturing</td>
<td>WB16FS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts, Inc</td>
<td>SWX-4029</td>
<td>U-shaped wire to support water bottle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

an alternant method to the traditional nasa hindlimb unloading model in mice

モレ-ホルトン後肢アンロード（HU）メソッドは、広く受け入れられている米航空宇宙局（NASA）げっ歯類4-6に廃用-萎縮を研究するための地上ベースのモデルです。我々の研究は、マウスのゴールドスタンダードモレ-ホルトンHUテールトラクションテクニックに交代方式を評価した。 54雌マウスでは、（4-8ヵ月）、14日間HU（N = 34）または28日（N = 20）であった。 HUからの回復は、HU（N = 22）に続く通常のケージの歩行の3日後に評価した。高齢マッチしたマウス（n = 76）は体重を支えるの対照として用いた。 前のHUにテールリングは5 番目 、6 番目 、または7日間脊椎のディスク容量を通過し、マウスが中断されたからリングに成型された2から0滅菌外科用鋼線で形成された。テールリングのための椎体の位置が適切に排便を妨げることなく、動物の体重のバランスをとるために選ばれました。 私たちはHU、ヒラメ筋萎縮の程度、および副腎腫瘤は、次のHUの前後に体重を評価することでこの小説HU技術の成功を決定する。前のHU（24.3 ± 2.9グラム）にマウスの体重は有意に（24.0 ± 1.8グラム）HUの14D（22.7 ± 1.9グラム）、HUの28D（21.3 + 2.1グラム）後、または3日間の回復後すぐに低下していない。ヒラメ筋の質量が大きく、それぞれ14日と28日間のHU（P &lt;0.001）以下の（-39.1％、および-46.6％）減少しました。回復ヒラメ筋の質量の3日間に続いて大幅にコントロール値の74％に増加した。 HUマウスの副腎重量は対照マウスに比べて差は認められなかった。 私たちの小説のHUの方法の成功は予想される文献の値に対応するHU、2、7、8に続く動物の体重、匹敵する副腎の重量、およびヒラメ筋萎縮のメンテナンスにより証明される。このHUの方法の主な利点は次のとおり：1）サスペンションの間にテール検査のしやすされない、2）チアノーゼ、炎症の可能性を減少、および/または頻繁にテールテーピングとHUで観察壊死尾、トラクションを噛むマウスの3）も可能すぐにHU後急速に回復し、通常のケージの活動、4）、テープやサスペンション装置から出てくる。

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An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

我々は、マウスでモデルをアンロード交代後肢を開発した。従来のモレ-ホルトンテールトラクション法上の私たちの後肢アンテールリング方式の主な利点は、動物によってストレスを最小限に抑える簡単な簡単な手順です。

マウスにおける伝統的な米航空宇宙局（NASA）後肢アンロードモデルへの交代方法

The Morey-Holton hindlimb unloading (HU) method is a widely accepted National Aeronautics and Space Administration (NASA) ground-based model for studying ...

an-alternant-method-to-traditional-nasa-hindlimb-unloading-model

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K ビュー.  University of Missouri, Columbia. 我々は、マウスでモデルをアンロード交代後肢を開発した。従来のモレ-ホルトンテールトラクション法上の私たちの後肢アンテールリング方式の主な利点は、動物によってストレスを最小限に抑える簡単な簡単な手順です。

ビデオ: An Alternant Method to the Traditional NASA Hindlimb Unloading Model in Mice

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

後脚虚血症のマウスモデル

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

生物学

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

マウスの腸内細菌叢に及ぼすバクテリオシンの影響を評価する方法

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Bioluminescent Monitoring of Graft Survival in an Adoptive Transfer Model of Autoimmune Diabetes in Mice

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease is the transplantation of stem cell-derived beta cells. Genetic modifications, however, may be necessary to protect the transplanted cells from persistent autoimmunity. Diabetic mouse models are a useful tool for the preliminary evaluation of strategies to protect transplanted cells from autoimmune attack. Described here is a minimally invasive method for transplanting and imaging cell grafts in an adoptive transfer model of diabetes in mice. In this protocol, cells from the murine pancreatic beta cell line NIT-1 expressing the firefly luciferase transgene luc2 are transplanted subcutaneously into immunodeficient non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (scid) mice. These mice are simultaneously injected intravenously with splenocytes from spontaneously diabetic NOD mice to transfer autoimmunity. The grafts are imaged at regular intervals via non-invasive bioluminescent imaging to monitor the cell survival. The survival of mutant cells is compared to that of control cells transplanted into the same mouse.

This protocol describes a straightforward and minimally invasive method for transplanting and imaging NIT-1 cells in non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient mice challenged with splenocytes purified from spontaneously diabetic NOD mice.

マウスにおける自己免疫性糖尿病の養子移植モデルにおける移植片生存の生物発光モニタリング

Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of the insulin-producing beta cells of the pancreas. A promising treatment for this disease ...

Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age and overall health status of the patient, failures can occur, leading to delayed union or nonunion. Due to the increasing number of fractures resulting from high-energy trauma and aging, the development of innovative therapeutic strategies to improve bone repair based on the combination of skeletal/mesenchymal stem/stromal cells and biomimetic biomaterials is urgently needed. To this end, the use of reliable animal models is fundamental to better understanding the key cellular and molecular mechanisms that determine the healing outcomes. Of all the models, the mouse is the preferred research model because it offers a wide variety of transgenic strains and reagents for experimental analysis. However, the establishment of fractures in mice may be technically challenging due to their small size. Therefore, this article aims to demonstrate the procedures for the surgical establishment of a diaphyseal femur fracture in mice, which is stabilized with an intramedullary wire and resembles the most common bone repair process, through cartilaginous callus formation.

This protocol describes a surgical procedure for the establishment of a diaphyseal fracture in the femur of mice, which is stabilized with an intramedullary wire, for fracture healing studies.

マウスにおける骨幹大腿骨骨折モデルの確立

Bones have a significant regenerative capacity. However, fracture healing is a complex process, and depending on the severity of the lesions and the age ...