LRC - V。博士Adriel D.ジョンソン、その最優先事項は、常に学生の教育であった素晴らしい教授のメモリにこの論文を捧げたいと考えている。我々は、Adrielをあなたがいなくて寂しい。我々は本研究で説明されている実験を行うことで彼女の助けのためのジャクリーンモレノに感謝しています。この研究は国立科学財団、MCB - 0615390から、とLRC - Vに提供スタートアップ資金でCYに提供する助成金によって支えられている。ハンツビルのアラバマ大学から。

1。無細胞抽出物の調製。 <ol><li>中期対数増殖期の培養物から得られた乾燥大腸菌細菌ペレットの2グラムはバッファの半リットルを含む10mMのTris -酢酸、pH8.0の14 mMの酢酸マグネシウム、60mMの酢酸カリウム、および50μgを、二回、洗浄されています4℃で5分間5000 × gで遠心分離によって/ mLのphenylmethanesulphonylfluoride（PMSF）℃洗浄後、細菌ペレットを緩衝液A 40mLに再懸濁している</li><li>細菌細胞は6,000 psiの圧力を加え、フレンチプレスを用いて破砕する。この圧力は、1インチのピストンを使用して600台に相当する。破砕懸濁液を清浄なガラス管（50mL）に収集されます。 </li><li>破砕懸濁液を1mMのdithiotreitol（DTT）で処理され、30分間、30,000 xgで遠心分離されています。遠心分離の手順は、得られた上清を用いて、繰り返されます。最後の上清をマイクロチューブに（1 mL）に分配される。最後に、アリコートをドライアイス - エタノールの混合物または液体窒素を用いて凍結され、-60℃でまたは-80℃で保存されています</li></ol> 2。 RF2が枯渇細胞フリー抽出物の調製。 <ol><li>プロテインAセファロース4Bのスラリーのビーズの4.5mLのは、1時間、室温で回転するホイール​​を使用してアンチエイリアスRF2抗血清5mLを混合される。混合物は、抗血清からビーズを分離するために2500 × gで遠心分離されています。廃棄時に上清を、抗- RF2抗体（抗- RF2ビーズ）を含むこれらのビーズは、後に35ミリを含む緩衝液Bの1mLに再懸濁により洗浄し、Tris -酢酸pH7.8の、10mMの酢酸マグネシウム、30mMの酢酸アンモニウム、60 mMのカリウムのグルタミン酸およびロイペプチンプロテイナーゼ阻害剤の5μg/ mLの。抗RF2ビーズを上記と同じ条件を用いて遠心分離することにより、バッファBから分離されています。洗浄手順が2回繰り返されます。 </li><li>無細胞抽出液の一液は4℃、回転するホイール​​を使用して抗RF2ビーズを150μLと混合され° C、2時間。混合物をビーズから無細胞抽出液を分離するために10,000 × gで遠心分離される。上清を、抗- RF2ビーズの別の150μLで再び削除され、扱われます。この手順は、結果として得られる無細胞抽出液の溶液で1回以上繰り返されます。最後の無細胞抽出液をマイクロチューブに（100μL）分配される。アリコートは、ドライアイス - エタノールの混合物または液体窒素を用いて凍結され、-60℃でまたは-80℃で保存されています</li></ol> 3。 DNAテンプレートの調製。 <ol><li>図1に示すオリゴヌクレオチドのそれぞれ0.4ナノモル、各dNTP、0.2マイクロモルとの50 Uで、翻訳される配列を含むプラスミドテンプレート600 femtomoles（図1）を混合することにより、1 mLのPCR反応を準備するTaqポリメラーゼ、ストラタジーン社によって提供されたバッファ内のDNAポリメラーゼは、以下の条件の下で増幅反応を行ない、94℃で2分間、（94℃30秒、55℃30秒、72℃で1分間、30サイクル）、72℃で12分間。 </li><li>の3 M酢酸ナトリウム、pHは5.2、および氷冷エタノールを2倍量の1 / 10量を添加することによりDNAを沈殿させることによってPCR産物を精製する。もう一度降水の手順を繰り返します。ジエチル-ピロカーボネート（DEPC）処理水100μLでDNAを再懸濁します。 通常、この手順は、600bpのDNA産物の100μgを得られます。 </li><li>アガロースゲル上で電気泳動によってPCR産物の整合性を確認してください。 </li></ol> 4。ビオチン標識されたmRNAの調製。 <ol><li> ATP、CTP、GTP、UTPの0.3マイクロモル、ビオチン- 16 - UTPの50ナノモル、および10μLの0.5マイクロモルでPCR -生成されたDNA断片の5μgを混合することにより、DEPC処理水でのin vitro転写反応で 100μLを準備するプロメガ（株）から提供されたバッファ内のT7酵素ミックスを37℃で反応混合物をインキュベート℃で3時間。 得られたmRNAの量を定量化するため、DNAテンプレートをRNaseフリーのDNaseを添加することにより除去されるべきである。 37反応℃で10分間インキュベートする。 </li><li>の3 M酢酸ナトリウム、pHは5.2、および冷エタノール2容量の1 / 10量を添加することによりRNAを沈殿させることによってmRNAの製品を精製する。もう一度降水の手順を繰り返します。 DEPC処理水100μLでmRNAを再懸濁します。 通常、600 NTビオチンの1〜2 mgの間に、この手順の収量は、mRNAの製品のラベルが付いた。 </li><li>アガロースゲル電気泳動でビオチン標識されたmRNAの製品の整合性を確認してください。 </li></ol> 5。ペプチジルtRNAを含む翻訳リボソームの分離。 <ol><li> nineteenアミノ酸-すべての放射性アミノ酸に置換されるアミノ酸を除いて、それぞれの75ナノモルとビオチン標識されたmRNAの10〜15μgを混合することにより、DEPC処理水でのin vitro翻訳反応混合物中の500μLを準備50放射性アミノ酸（37MBq）のμCiの、そして20から5<html> 40mMのTris -酢酸、pH8.0の、10mMの酢酸マグネシウム、175 mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸アンモニウム、2mMのDTT、2mMのATP、0.5を含む緩衝反応混合物中のRF2枯渇無細胞抽出液の0μL、 mMのGTP、30mMのホスホエノールピルビン酸（PEP）、0.3 U / mLのピルビン酸キナーゼ（PK）、3.5％ポリエチレングリコール8000、1 mMのスペルミジン、20μg/ mLのフォリン酸、および250μgの/ E.からmLのtRNAの大腸菌 。 37℃反応混合物をインキュベート℃で10分間。 反応成分の添加順序は非常に重要です。無細胞抽出液は、アミノ酸とリボソームの活性化を可能にするために室温で5分間インキュベートした最終的な混合物を含む緩衝液で初のミックスされている必要があります。後、ビオチン標識されたmRNAが追加されます。化学修飾の手順を使用して構造解析のために、放射性アミノ酸を付加する必要はありません。 </li><li> 35 mMトリス - 酢酸、pH8.0の、10mMの酢酸マグネシウム、175 mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸アンモニウムおよび1mM DTTを含む緩衝液Cで中断されたストレプトアビジン磁性ビーズ（SMB）の3mLの - 翻訳反応混合物に追加。 10分間室温で新しいサスペンションをインキュベートする。 </li><li>磁気分離スタンドを使って磁場（MF）を適用することによって混合物からSMBを区切ります。 </li><li>バッファーCでSMBを再懸濁し、MFを使用して、再びビーズを区切ります。二度この洗浄操作を繰り返します。バッファーCの500μLでビーズを再懸濁し、氷上でサスペンションを格納し、そしてすぐに次の手順を実行します。 </li></ol> 6。ペプチジルtRNAを含む絶縁型リボソームの解析。 ペプチジル- tRNAのための<ol><li> 50mMトリス- HCl、pHを6.8、2.5％（v / v）グリセロール、4％のドデシル硫酸ナトリウム、2mMのDTTおよび0.2 mgを含むローディングバッファー10μLでSMBの10μLを（バッファーCで中断）ミックス/ mLのブロモフェノールブルー。 10パーセントトリス-トリシンポリアクリルアミドゲルでサンプルを実行することにより、ビーズに接続しているコンポーネントを解決します。 </li><li>真空ゲル乾燥機を使用してゲルを乾燥させる。 </li><li> X -線フィルムに乾燥ゲルを公開することにより、ペプチジル- tRNAの完全性と精製を確認してください。 </li></ol>リボソームRNAのための<ol start="4"><li> DEPC処理水で調製した2 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を190μL、及びビーズ懸濁液の10μLに、水で平衡化したフェノール200μLを加える。積極的なボルテックスで懸濁液を混合し、室温で3分間、10,000 xgで遠心分離して有機相からの無機相を分離。新しいマイクロチューブの上部に水の層を収集する。 </li><li> 1月10日の3 M酢酸ナトリウムの量、pHは5.2、グリコーゲン溶液、および氷冷エタノールの2倍量の20 mg / mLの1μLを加えることにより水層からRNAを沈殿させる。 DEPC処理水10μLのRNAを再懸濁します。 </li><li>アガロースゲル上で電気泳動によるリボゾームRNAの整合性を確認してください。 通常、ビーズの懸濁液50μLは、リボソームRNAの1μgのが得られる。 </li></ol> 7。代表的な結果： 図2に示した手順を使って分離された翻訳リボソームの品質と機能性を評価する一連の分析の結果を示す。ポリアクリルアミドゲル中で解決されたユニークなバンドの観察は、SMB（図2A）に接続されたビオチン標識mRNAに結合したポリペプチドの存在を示している。この手順を使用して、リボソームRNAの精製は、同様に、これらのビオチン標識mRNAに結合した（図2B）リボソームの存在を確立。ピューロマイシンのほか、リボソームのペプチジル-トランスフェラーゼ活性を誘発する抗生物質、発生期のペプチジル- tRNAの1の切断の結果。これは、ポリアクリルアミドゲルで単離されたポリペプチドの移行パターン（図2C）のシフトとして観測される。一緒に、これらのデータは、SMBに接続されたビオチン標識mRNAがペプチジル- tRNAのと機能的なリボソームが含まれていることを示している。 特定のペプチジル- tRNAを含む翻訳するリボソームの分離は、リボソーム機能（図3A）で、ペプチジル- tRNAは、抗生物質、および他の分子の効果の研究を許可し、リボソームの構造上（図3B）。例ではここに抗生物質sparsomycinを提示し、アミノ酸トリプトファン（Trp）が分離されたリボソーム（図3A）のRF2により誘導された新生tnaC - tRNAはペプチジル- tRNAの加水分解を阻害する。リボソームとsparsomycinまたはTrpの相互作用はまた、翻訳リボソーム（図3B）の23S rRNAを構成するいくつかのヌクレオチドの構造変化を誘導する。要約すると、手順を使用して得られた生物学的物質は、様々な分子の因子との相互作用時にリボソーム機能の阻害に関与する構造的なコンタクトの追加の理解を得る上で有用であるここで説明する。 ove_content&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ペプチジル- tRNAを含む翻訳するリボソームを生産し、精製するために使用される手順。 DNAは、CAを断片化します。図に示すように、tnaC遺伝子とその隣接領域を含む長さの650 bpのは、、、ビオチン、[（バイオ）UMP] mRNAを含むmRNAを調製するのにテンプレートとして使用されます。これらのDNA断片は、図の上部に示されるオリゴデオキシヌクレオチドを​​用いたPCRの手順によって生成されます。下線付きの英字は、ヌクレオチドプライマーでエンコードされたT7プロモーターの位置をマーク。太字はtnaC mRNA配列の翻訳に使用されているシャインダルガーノ配列を示している。 DNA断片のT7プロモーターが（矢印）tnaCシーケンスと非コード配列の下流に転写するために使用されるT7 RNAポリメラーゼによって認識されています。転写は、RNAポリメラーゼがrpoBCターミネーター配列（rpoBC&quot;T&quot;）の後、DNA断片の3&#39;末端に達すると終了します。 rpoBCターミネータのステムループ構造は、in vitro翻訳反応でで使用されている無細胞抽出物中に存在する3&#39; - 5&#39;exoribonucleaseの活動からmRNAを保護します。孤立した[（バイオ）UMP] mRNAはin vitro翻訳アッセイを使用して 、停止、翻訳リボソームを生成するために使用されます。 tnaCのシーケンス[（バイオ）UMP] mRNAは、反応混合物から起因リリース因子の不在（RF2）に、最後のアミノ酸を組み込まれているときに失速リボソームによって翻訳されています。リボソーム- [（バイオ）UMP] mRNAの複合体がmRNAに組み込まれてビオチン標識ヌクレオチドを​​結合するストレプトアビジン磁性ビーズ（SMB）を使用して全反応混合物から分離されています。中堅中小企業は、[（バイオ）UMP]のmRNA複合体を磁場（MF）を使用して全反応混合物から抽出された-リボソームに結合。 <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="図2" /> 図2分離された複合体の構造と機能解析。 A） で、in vitro翻訳反応は、[（バイオ）UMP]でtnaC遺伝子の開始コドンが終止コドンで置換したmRNAを行った。図1に示されるように最終的な製品は、ストレプトアビジンビーズを用いて単離した。反応生成物と分離された分子をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分析した。 tnaC - tRNAおよびtnaCペプチドのバンドがマークされます。 B）全RNAはフェノール抽出の手順を使用して停止した複合体から単離された。それぞれの分離されたRNAをアガロースゲルで電気泳動することによって解決されました。リボソームRNA（rRNAs）が示されます。 C）tnaC - tRNAを含む絶縁型錯体は、と（+）またはなしでインキュベートした（ - ）10分間室温で0.02mMのピューロマイシン（ピューロ）。 tnaCのペプチドは、[35S] -メチオニン（A）または[3 H] -プロリン（B）を使用して、変換中に標識した。 <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。抗生物質sparsomycin、またはアミノ酸のトリプトファンにバインドされているtnaC - tRNAを含むリボソームの構造と機能解析。 A）tnaC - tRNAを含む絶縁型錯体は、と（+）または（なしインキュベートした- ）sparsomycin（スパー）または5分間室温でトリプトファン（Trp）。後、混合物はRF2と混合し、37℃で20分間インキュベートした。リボソーム内で結合する分子により誘導された23S rRNAの中のメチル化変化のB）の分析。隔離された複合体は、と（+）またはなしでプレインキュベートした（ - ）37℃で5分間、2mMのTrpまたはスパー℃にその後、アルキル化剤、硫酸ジメチルは、追加され、混合物は、さらに20分間室温でインキュベートした。トータルRNAを抽出し、プライマー伸長アッセイは、[32P]修飾ヌクレオチドから下流に100塩基の間隔をあけている23S rRNAの塩基に相補的な標識されたオリゴヌクレオチドを​​用いて行われた。伸長アッセイの最終製品は、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離した。 Trpまたはスパーの存在によって影響を受ける23S rRNAの塩基が示されている。

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレポートに記載されて、この分離手順では、高い再現性です。残念なことに、同じ翻訳配列から生成された短いペプチジル- tRNAの存在が便利に回避することはできません。このようなペプチジル- tRNAのは合計絶縁材料（図2C）の15-20％に対応することがあります。ビオチン標識されたmRNAの高い濃度が使用されているまたは使用される無細胞抽出液が古い場合や、何度も再使用されているときに、これらの汚染物質は、濃度に増加する場合があります。したがって、in vitro翻訳反応でのコンポーネントの品質と濃度を制御するために非常に重要です。また、商業的な高効率無細胞抽出液を再構成した同じ目的（PUREシステム）18のために使用できる利用可能です。 この方法を使用して、ビオチン- 16 - UMPは、ランダムにターゲットmRNAの長さに沿って組み込まれています。ウリジンのトラクトを含むいくつかのORFは、その翻訳に影響を与えず、それらの配列にこの修飾ヌクレオチドを​​組み込んだている可能性があります。 biotin-16-UTP/UTPの変数の相対濃度は、最も効率的な翻訳を得るために、mRNAの合成中にテストする必要があります。ビオチン標識の代替法は、mRNAの5&#39;末端、最も安定したエンドをターゲットに、使用することができます。 （ⅰ）ビオチンは、3&#39; - NH2ATP（3&#39; -アミノ基、3&#39; -デオキシアデノシン三リン酸）とT4 RNAリガーゼ19を用いて mRNAの5&#39; -末端に結合することができます。 （ⅱ）5&#39;末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドは、T4 RNAリガーゼとしても20を用いてmRNAの5&#39; -末端に結合することができます。 （iii）のmRNAの5&#39;末端に相補的な配列に対応する3&#39;末端ビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドはまた、翻訳複合体を分離するために使用することができる。これらのビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドを​​分離する前に、SMBに接続することができます。後でSMBは、に接続されているビオチン標識オリゴデオキシヌクレオチドは、それらの相補的mRNA配列との相互作用を可能にするために、翻訳反応混合物と混合することができます。単離後、ハイブリッドRNA - DNA領域 - とビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびmRNA配列との間でハイブリダイズする領域は、 - ストレプトアビジンビーズから停止複合体を分離し、RNアーゼHを用いて劣化した可能性があります。この代替方法では、複合体は、高解像度の方法を使用して、将来の構造解析に用いることができる可能性があります。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

最近、構造的および生化学的研究は、抗生物質によるタンパク質合成の阻害の間と新生ポリペプチド合成中のリボソームに発生する分子事象の多くを紹介しています。これらの抗生物質、および主にペプチジル- tRNAの形で規制の新生ポリペプチドの一部は、ペプチド結合の形成や翻訳終止1から7のいずれかを阻害する。これらの抑制イベントは、リボソームの動き、&quot;トランスレーショナル逮捕&quot;と呼ばれる現象を停止することができます。抗生物質または新生ポリペプチドのいずれかにより誘導される翻訳の停止は、細胞増殖、抗生物質耐性、タンパク質転移と細胞の代謝8月13日などの多様な細胞機能に関与する遺伝子の発現を調節することが示されている。我々はあらゆる生物において、翻訳におけるリボソームの役割を完全に理解したならば、抗生物質と規制の新生ポリペプチドは、リボソームの機能を変更する方法の知識が不可欠です。 ここで、我々は、排他的に、浄化分析のために、それらのリボソームは特定のmRNAを翻訳し、特定のペプチジル- tRNAの14を含むために使用できるシンプルな方法論を説明します。この手順は、ビオチン標識されたmRNAに結合したリボソームの翻訳の選択的分離に基づいています。これらのトランスレーショナル複合体はストレプトアビジン磁性ビーズ（SMB）と磁場（MF）を使用して、同じ混合物中の他のリボソームから分離されています。ビオチン標識mRNAがT7転写プロモーターを含むテンプレートPCR -生成されたDNA断片として使用してランオフ転写アッセイによって合成される。 T7 RNAポリメラーゼは、ビオチン- UTPからビオチン- 16 - UMPを搭載し、我々の条件下で約10ビオチン- 16 - UMPの分子は25％UMPの含有量600 NTのmRNAに組み込まれています。これらのビオチン標識mRNAがその後分離し、放出因子2（RF2）で実行vitro翻訳アッセイにおいて使用されている枯渇野生型または変異型リボソームを含む大腸菌の菌株から得られた無細胞抽出液を。ビオチン標識されたmRNA配列を翻訳するリボソームが原因で、通常、翻訳終結を達成RF2タンパク質の不在に、終止コドンの領域で停滞している。新たに合成されたペプチジル- tRNAを含むストールしたリボソームを単離し、SMBとMFを使用して翻訳反応から削除されます。これらのビーズは、ビオチン含有メッセージをバインドします。 隔離された、翻訳複合体は、野生型または変異型リボソームのコンポーネント、またはペプチジル- tRNAのシーケンスだけでなく、抗生物質または他の分子の要因1,14-16とリボソームの相互作用を決定するための構造的および機能的特徴を分析するために使用することができます。これらの単離されたリボソーム複合体の機能を調べるために、ペプチジル-トランスフェラーゼアッセイは、抗生物質ピューロマイシン1の存在下で行うことができます。翻訳複合体の構造変化を調べるために、十分に確立された手順は、特定のアミノ酸14および/ ​​またはii）アルキル化保護アッセイ1,14,17に）そのような私として、架橋を使用することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル- tRNAを含むリボソームを精製するための単純な方法論を開発。

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

19.7K ビュー.  University of Alabama Huntsville. ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル- tRNAを含むリボソームを精製するための単純な方法論を開発。

ビデオ: Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

生物学

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA含有エキソソームの単離と解析

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.