この研究はまた、CIHR若手研究者賞を受賞され、それに健康の研究助成金のカナダの協会（CIHRからMOP-115195）とFRQ-Sによってサポートされていました。とスウェーデンの研究評議会とスウェーデンの癌協会はOLする

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著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

この記事では、哺乳動物細胞におけるゲノムワイド規模で翻訳活性の質的および量的な変化を捉えるために社内開発の分析方法に続いて十分に確立されたポリソーム分画プロトコルについて説明します。このプロトコルは特別な注意が正常に完了したが、1）細胞集密度に支払われるべきであるため増殖率と栄養利用は、mRNAの翻訳活性と相関し、translatomeの構成に影響を与えることができるように（、細胞集密度）を複製した実験条件間で一貫している必要があり、 2）急速な細胞溶解（シクロヘキシミドおよびバッファ内のRNA分解酵素阻害剤の存在にもかかわらず、溶解が迅速かつ細胞抽出物がすぐにRNA分解やポリソームの解離を防止するための溶解後に、ショ糖勾配上にオーバーレイされるべきであるべきである）、3）グラデーション準備（確保するための高いデータ再現性、スクロース勾配は、勾配メーカー、SPEを用いて調製されるべきである）、それらを処理する際に金融注意が必要です。 翻訳活性の変化を研究することに加えて、このプロトコルは、リボソーム関連タンパク質複合体を単離し、それらの生理学的機能を確立するために使用することができる。リボソーム関連タンパク質複合体は勾配分画から免疫沈降し、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法によって分析することができるのに対し、この目的のために、種々のリボソーム関連タンパク質のレベルおよびリン酸化状態は、ウェスタンブロッティング、続いてTCA沈殿により決定することができる。この手法の欠点は、遅い勾配分画法が結合動態の急速な結合/解離にあっても強固に結合したタンパク質の解離を引き起こす可能性があることです。新たに合成されたポリペプチドに関連した要因は、典型的な例である。リボソームを構成する新興新たに合成されたポリペプチドは、3のような化学的架橋剤を使用してリボソームに関連するタンパク質複合体上に固定化することができる、3&#39;-ジチオビス[スルホスクシンイミジル]（DTSSP）31。このアプローチは、受容体活性化Cキナーゼ1（RACK1）/ c-Jun N末端 ​​キナーゼ（JNK）/真核生物翻訳伸長因子1A2（EEF1A2）錯体がストレス27に応答して新たに合成されたポリペプチドの分解を調節すること。明らかにまた、同様の方法論は、タンパク質キナーゼC BII（PKCbII）はRACK1 32によりリボソームへ補充されるおよびmTOR複合体2（mTORC2の）の活性化は、それが新たに合成されたAKTポリペプチドをリン酸化し、それらを調節するリボソーム上で起こることを示す研究に使用した安定性33,34。 anota分析を行っソーム分画法の主な制限は以下のとおりです。細胞の比較的多数（〜15×10 6細胞）のための1）の要件、2）指定されたmRNA分子上のリボソームの局在に関する位置情報の欠如、および3細胞および分子ヘテロに関連する）の​​問題正常組織および腫瘍組織のgeneity。必要な細胞数に関連する問題は、量、高存在量の細胞（ 例えば HeLa細胞）35から得られたものと限定された細胞のモノソーム（80S）に対応する吸光度スペクトルピークを整列させることによって解決することができる。例えば、ヒト組織のような複雑なシステムから得られた遺伝子発現の変化の解釈上の組織の不均一性の交絡効果に関連する問題が議論されているのに対し、リボソームプロファイリング技術（下記参照）は、所与のmRNA分子上のリボソームの正確な位置を決定するために使用することができるネギやストーリー36による刊行物に詳細が。 最近では、技術をプロファイリング小説リボソームはリボソーム保護された断片（RPFS）はRNA分解酵素I処理によって生成され、ディープシーケンシング22によって解析され、開発されました。この技術は、それによって、これまで提供した一塩基分解能でリボソーム位置の決定を可能にするUNPRリボソーム生物学へのecedented洞察。例えば、リボソームプロファイリングは、指定されたmRNA分子、またはそのような代替開始部位、非8月コドンなどuORFsなどの調節エレメントの開始などの影響翻訳開始率、その要素の識別にリボソーム密度の測定のために使用することができます。しかし、正確にmRNAの翻訳効率を推定するリボソームプロファイリングの能力を制限するいくつかの方法論的な制限があります。これらはランダムな断片化とリボヌクレアーゼI消化により導入された独立したバイアスを含み、翻訳阻害剤（例えば、エメチンやシクロヘキシミドなどなど 、伸び阻害剤は翻訳開始部位でのリボソーム蓄積を誘導する可能性がある）により導入されたバイアスは、偽陽性や偽陰性の結果の多くは、関連するTEスコアだけでなく、予測する上で、その不正確さとそれがタンパク質をコードするmRNA 37から発信読み込みます。おそらく最も重要なのに対し、リボソームプロファイリングが与えられたmRNA分子上のリボソームの位置を直接同定を可能にする、指定されたmRNAと関連しているリボソームの数は、間接的に、合計（ランダムに断片化されたmRNAに観察されたものの上にRPFS（リボソーム関連するmRNA）を読み込みの頻度を正規化することによって推定されているmRNA）の。例えば、4つの「B」mRNA分子（BaとBbは、BCおよびBdの）は、位置1、2、3、4、リボソームプロファイリング技術の固有の欠点で4リボソームによって占有されている単純な設定では許可しないシナリオここで、すべてのリボソーム関連付けるだけBaの位置1におけるmRNA、2、3、4およびBa、Bbは、BCおよびBdのmRNAは、各位置での1つのリボソームによって占有されるシナリオで、2の区別それぞれ図3、図4、。これとは対照的に、ポリソーム分画の間に、ポリソーム完全性は、それによってリボソームの定義された数（ 図1）に関連するmRNAのプールの単離を可能に、保持されます。このインポートソーム分画およびリボソームプロファイリング間の蟻の区別は、前者の方法は、直接のmRNPの軽重ポリソーム画分中のmRNAを比較するために使用することができるが、後者の方法は、おそらく移行からのmRNAによって引き起こされるtranslatomeの変更をキャプチャするために失敗することを示唆している重いポリソームへのmRNP分からシフトしているものの寄与を過大評価している間、重いポリソームに点灯します。前述の方法との間に、これらの矛盾の生物学的意義は、保有するものと他のもの、一方で、このようなのeIF4Eと小文字が区別されているようなmRNAのサブセットの翻訳活性化を示すデータの大きな体、光から重いポリソームへの移行によって強調される5&#39;TOP要素は、直接リボソームのないmRNAの6のプールから重いポリソームに補充される。興味深いことに、mTOR経路は、同時に「eIF4Eの敏感な」及び5&#39;TOP mRNAの1の翻訳を調節することが示されている1であるため、上述された方法論の違いはtranslatome上のmTOR阻害の効果を評価するためにプロファイリング38,39リボソーム及びポリソーム分画24を用いた研究の結論の間の見かけの不一致を説明することができる。 結論として、ポリソーム分画およびリボソームプロファイリングは、主にそれぞれのmRNA上のmRNAとリボソームの位置に関連したリボソームの数に関する情報を提供する補完的なメソッドです。重要なことに、これらの方法の欠点と利点にもかかわらず、それは両方の手順によって得られたゲノムワイドなデータを適切に分析し、機能的にも生化学的に検証されることが不可欠で残っている。

遺伝子発現を制御する調節ネットワークは、広範囲に、最後の20年間に研究されてきた。ゲノムワイドスケールでの定常状態のmRNAレベルの変化は、いわゆる「遺伝子発現」プロファイルを決定するために使用されたことにより、転写調節に焦点を当て、これらの研究努力の大半。最近の研究では、定常状態のmRNAレベルが緩く、それにより、mRNA翻訳などの転写後メカニズムは、遺伝子発現3,4の調節において主要な役割を果たすことを示す、プロテオーム1,2の組成に相当することを明らかにした。実際に、〜のタンパク質レベルの50％が不死化マウス線維芽細胞5におけるmRNA翻訳のレベルで決定されると推定されている。 mRNAの翻訳は、mRNAがリボソームの編成作用を介してタンパク質に翻訳される間の高度に調節されたプロセスである転移RNA（tRNAは）と付属要因COmmonly翻訳因子（TFS）6と呼ばれる。タンパク質合成は、哺乳動物細胞7で最もエネルギーを消費するプロセスであり、したがって、全体的なmRNAの翻訳速度は、栄養利用および細胞増殖速度8を収容するように調整される。全体的なmRNAの翻訳速度の変化に加えて、種々の細胞外刺激（ 例えばホルモン及び成長因子）、細胞内の手がかり（ 例えば、アミノ酸レベル）およびストレス（ 例えば、ERストレス）の異なるタイプがあるmRNAのプールにおける選択的な変化を誘導（translatome）6を翻訳さ。刺激、いくつかの翻訳活性ではなく、のタイプに応じて、全てのmRNAが劇的に、それによって迅速な細胞応答6を取り付けるために必要とされるプロテオームの変更を伴う、影響を受けます。 translatomeにおけるこれらの定性的および定量的変化は、トランス作用因子間の相互作用（ 例えばにより媒介されると考えられている</EM&gt;翻訳機構は、補助因子またはmiRNA）はおよびmRNAの6,9の選択されたサブセットに存在するシスエレメント（RNAエレメントまたは機能）の成分。例えば、レベルおよび/ ​​または律速翻訳開始の活性の変化は、eIF4Eのとは、eIF2が選択特定の5&#39;UTRの特徴6に基づいて転写産物の翻訳を調節要因。のeIF4Eとは、eIF2は、それぞれ6、リボソームへのmRNAおよび開始tRNAの募集のために必要とされる。 eIF4Eの活性の増加は、選択的サイクリンのc-mycおよびBcl-xLの10を含むタンパク質をコードするもの刺激増殖および生存を含む長いと高度に構造の5&#39;UTRを保有するmRNAの翻訳をボルスタ。今度は、eIF2はの不活性化は、選択的にこのようなコードするものマスターTとしてのの5&#39;UTRが短い阻害上流オープンリーディングフレーム（uORFs）を含むmRNAの翻訳を調節しながら、全体的なタンパク質合成のシャットダウンにつながる小胞体ストレス応答（ 例えば ATF4）のranscriptionalレギュレータです。 MAPK経路は直接リン酸化し、一方、栄養素、成長因子およびホルモンを含む様々な刺激に応答して、ラパマイシン（mTORの）経路の哺乳類/機構的標的は、翻訳抑制の4E-結合タンパク質（4E-BP）ファミリーを不活性化することによって、eIF4Eの活性を刺激する6,11 EIF4E。今度は、eIF2αリンキナーゼ（ すなわち PERK、PKR、HRIとGCN2）は栄養枯渇、ERストレスやウイルス感染6,12に応答して、そのeIF2αリン調節サブユニットをリン酸化することによっては、eIF2を阻害する。 TFの活性および/ ​​または発現の変化は、翻訳機構およびmiRNAを含む調節因子の他の構成要素は、がん、メタボリック症候群、神経学的及び精神障害、腎および心血管疾患13〜19を含む様々な病理学的な状態で観察されている。まとめると、これらのデータは、その並進私を示すchanismsは、細胞の恒常性を維持する上で、それらの抑止は、様々なヒト疾患の病因において中心的な役割を果たしている中心的な役割を果たしている。 ここで、モノソーム、リボソームサブユニットメッセンジャーリボ核タンパク質粒子（mRNPs）からポリソームを分離するために使用される哺乳動物細胞におけるショ糖密度勾配遠心分離によってポリソームの分画のためのプロトコルが記載されている。これが不十分（光ポリソームに関連する）、翻訳mRNAから効率的に翻訳（重いポリソームに関連付けられている）との識別を可能にします。このアッセイでは、リボソームは、シクロヘキシミド20およびサイトゾル抽出物を遠心分離によって5-50％線状スクロース密度勾配上で分離されているような翻訳伸長阻害剤を用いたmRNA上に固定化される。ショ糖勾配のその後の分別は、それらが結合しリボソームの数に応じて、mRNAの単離を可能にする。各画分から抽出されたRNAは、その後決定することができる異なる条件間の勾配を横断するmRNAの分布の変化、それによって勾配の上から下への翻訳効率が向上する。ノーザンブロッティングまたは定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を、各画分中のmRNAのレベルを決定するために使用される。 代替的に、重いポリソーム（典型的に3つ以上のリボソーム）を含有する画分をプールし、ゲノムワイド関連ポリソームmRNAレベルは、マイクロアレイまたはディープシーケンシングを使用して決定される。これは、ポリソーム関連するmRNAのレベルは、翻訳に加えて、サイトゾルのmRNAレベルに影響を与える21の転写および転写後メカニズムによって影響されることを強調するために最も重要である。したがって、ポリソーム関連mRNAからゲノムワイドなデータを用いて、翻訳の違いを決定するための換算はその上流にある遺伝子発現経路における工程からの影響を補正する必要があるTiONから21。このような補正を可能にするために、細胞質ゾルRNAは、各試料からのポリソーム関連RNAと並列に調製し、ゲノムワイドな定常状態のmRNAレベルを21に決定される。現在、いわゆる「翻訳効率」（TE）がゴール（ポリソーム関連mRNAのデータおよび細胞質のmRNAデータと、すなわち対数比）は、多くの場合の翻訳効率にサイトゾルmRNAレベルの変化の影響を補正するために使用されるmRNAを22与えられた。しかし、差動変換を識別するために、TEスコアを使用することは一般的に偽の相関27と呼ばれる、TEスコアの数学的な性質に起因する偽陽性や偽陰性所見のかなりの数に関連している。実際、複数のラボからのデータセットの調査は、このようなスプリアス相関がtranslatomes 23の変化を分析するときに避けられないように見えることを示した。これは、差動のtrの「分析の開発を促し<html>前述の欠点23の影響を受けないanslation」（anota）アルゴリズム、。 anota、分析中の回帰モデルは、細胞質ゾルRNAレベルの独立した翻訳活性の測定値を導出するために使用される。このような措置は、その後の条件と統計が計算されている間で比較する。ユーザーは、統計的検出力を向上させ、いくつかの複製24を用いた研究では偽陽性所見の発生を減少させ、分散収縮法を適用するオプションを持っています。重要なことに、最近anotaによって捕捉translatomeにおける摂動はなく、TEスコアは、25プロテオームの変化と相関することが実証された。したがって、それは非常にゲノムワイド規模での翻訳の変化を同定するためのanota分析を適用することを推奨します。 anotaアルゴリズムの理論的基盤が以前21,23,26詳細に議論されたが、ここでの焦点は、実際にそれを適用する方法である。 細胞中のmRNA翻訳活性の変化を研究することに加えてve_content &quot;&gt;、このリボソーム分画プロトコルが分離し、生化学的および機能的リボソーム及びポリソーム結合蛋白質複合体を特徴付けるために使用することができる。このアプローチは、正常に識別するために、過去に展開されている新たに合成されたポリペプチド27および/ ​​または翻訳機構の構成成分のリン酸化に関与しているの安定性を調節複合体は、ポリソーム分画法のこの適用はまた、簡単に説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

mRNAの翻訳は、遺伝子発現の調節において中心的な役割を果たし、哺乳動物細胞中で最もエネルギーを消費するプロセスを表す。従って、mRNA翻訳の調節不全は、癌を含む種々の病理学的状態において主要な役割を果たしていると考えられる。リボソームは、それにより新たに合成されたポリペプチドの機能と安定性の調節、発生期のポリペプチドの折り畳みを促進するシャペロンをホストする。また、新興のデータは、リボソームが、彼らは、リボソームから出てくるように新たに合成されたポリペプチドの翻訳後修飾の様々に関与している分子、および/または翻訳機構の成分を信号のレパートリーのためのプラットフォームとして機能することを示している。ここで、ショ糖密度勾配遠心分離を用いてリボソーム分画の十分に確立された方法が記載されている。社内開発した「anota &quot;アルゴリズムと併せて、この方法は、diffeの直接測定を可能にするゲノムワイド規模での個々のmRNAの翻訳rential。また、この多目的なプロトコルは、新たに合成されたポリペプチドのフォールディング及び分解において中心的な役割を果たすものを含むリボソーム関連タンパク質複合体の機能を分析することを目指し種々の生化学的研究のために使用することができる。

mTORは、栄養素利用19で全体的なタンパク質合成速度を調整し、セルラーネットワークの主要ノードです。 mRNA翻訳が律速開始段階6で、主に規制されている。ポリソームに従事してリボソームの割合は、積極的に翻訳開始速度28と相関する。 mRNAの翻訳に対するインスリンの効果を仲介するmTORシグナル伝達の役割を調査するためにポリソーム画法を適用した例が提示される。この目的のために、MCF7ヒト乳癌細胞は、低血清中で維持し、次いでインスリン単独で、または活性部位mTOR阻害Torin1との組み合わせで刺激した。連続的に低い血清中で維持した非刺激細胞は、対照とした。 mRNPs、モノソーム（80S）およびポリソーム画分をポリソーム分画法を用いて分離した。対照細胞と比較して、インスリンは、対応する勾配画分における吸光度の増加を誘導しポリソームに、一染色体分中の吸光度の減少が同時に起こる（ 図1）を伴う。これらの知見は、ポリソームに従事リボソームの割合は、したがって予想通り、インスリンは、グローバル翻訳開始速度を刺激する、ことを示す、対照細胞と比較して、処理されたインスリンが増加することを示している。 Torin1ことによりmTORシグナル伝達は、翻訳機構19に対するインスリンの効果を媒介に主要な役割を果たすという知見を裏付け、吸光度プロファイルに対するインスリンの効果（ 図1）を逆転させた。 勾配製剤の矛盾を避けることができない教義に基づいて、質問はポリソーム画法22を用いて得られたデータの再現性に関して提起されている。経験的に、この潜在的に有害な問題で、細胞質ゾルと重いポリソーム関連RNA（4以上のリボソームに関連するmRNA）をテストするために単離された<html> 4つの独立した生物学的複製からTorin1（ 図2）との組み合わせで、単独でインスリンまたはインスリンで処理したMCF7細胞から。細胞質ゾルおよび各反復における重いポリソーム関連mRNAの組成に、インスリンおよびTorin1の効果は、マイクロアレイ法を用いて、ゲノムワイドなスケールで決定した。主成分分析（PCA）を適用したポリソーム分画法の再現性を決定すること。このような分析は、異なる条件がよく（ 図2）を分離しながら、それぞれの条件に属するサンプルが密に二つの第一の構成要素内に配置されたことを示した。これらの知見は、ここで説明したようにポリソーム分画法は、再現性の高いゲノムワイドなレベルでの翻訳の量的および質的な変化を研究することが適切であることを示している。 ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; 図1 MCF7細胞におけるグローバル並進上でシグナリングを血清飢餓、インスリンおよびmTOR阻害の効果を示すポリソームプロファイル。MCF7細胞を、16時間の栄養素（0.1％FBS中で維持）を奪われ5nMのインスリン（INS）で処理し、単独で、または4時間250 nMのTorin1（INS + Torin1）と組み合わせた。連続的に栄養分を奪われた未処理の細胞（0.1％FBS）を対照として使用した。対応する細胞質ゾル抽出物を5〜50％ショ糖勾配上での遠心分離によって沈降させた。無料リボソームサブユニット（40Sおよび60S）、モノソーム（80S）と、ポリソーム画分中のリボソームの数が示されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> 図2。Pを使用して得られたゲノムワイドなデータolysomeプロファイリング高度に再現可能である。MCF7細胞を、 図1のように処理した。細胞質およびポリソーム関連RNA（&gt; 3リボソーム）は4つの独立した生物学的複製から抽出し、それらのゲノムワイドなmRNAレベルはGeneTitanアレイ（Affymetrix）を用いて決定した。 PCAは、得られるデータの再現性を評価した。 、RNAの原点（C =細胞質ゾル、P =ポリソーム関連）すべての処置のための最初の2のPCAコンポーネント（;; CTRL =コントロールイン=インスリンT1 =トリン1）も示されていると複製されます。同じ条件とRNA起源からの試料は、密接に高い再現性を示して配置されている。

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Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

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Research

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Biology

68.0K ビュー.  McGill University. リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができ?...

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

生物学

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

新しい多層フラスコを用いて哺乳動物細胞培養のスケールアップ

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...