この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省（BMBF）、（システム生物学上のヘルムホルツ·アライアンス）は、癌におけるシグナル伝達のシステム生物学とドイツ癌研究センター（DKFZ）によってサポートされていました。

全ての動物実験は、DKFZの制度ガイドラインに従って行った。 注意：サンプルのRNA分解酵素の混入を防ぐためRNaseのコンタミを回避するための基本的な予防措置を取り、DEPC処理水を用いてすべてのバッファを製造するために。 スクロース勾配の1。準備<ol><li> （ 表1参照）17.5、25.6、33.8、41.9および50％ショ糖溶液を調製する。ゆっくりポリアロマー超遠心管の底に50％スクロース溶液2mlを添加することにより、勾配の準備を開始。 -80℃で20分間チューブを配置することによって層をフリーズ</li><li> 17.5％のショ糖に終わる、その間の凍結ステップでショ糖の割合を減少さでその後の層を追加します。下の層の融解を防ぐためにショ糖溶液の添加の間、氷上で勾配を維持する。 </li><li>たての1日の使用前に、ショ糖勾配を準備し、4℃で保管しAlternativelYは、実験前の夜、4℃で-80℃と融解で、事前に店舗に勾配を準備します。 </li></ol> 2。組織調製（脊髄および/または脳） <ol><li> NaCl中のキシラジンおよびケタミンの過剰投与によりマウスを麻酔し、経関連転写上のリボソームを固定化する200μg/ mlののCHXを含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）20mlで灌流。つま先のピンチに非応答で適切な麻酔を確認してください。 </li><li>急速に組織を抽出します。頭蓋の背を開き、脳を抽出します。全体胸部および腰部脊柱の椎弓切除を行い、脊髄を抽出​​します。それぞれ、全脳（〜400ミリグラム）、または脊髄の4センチメートルピース（〜90 mg）を使用してください。 </li><li>シクロヘキシミドの取り込みの増加を可能にし、サイコロきれいなメスを用いて小片に：;：氷の冷たい均質化緩衝液A（ 表1参照）（4ミリリットル脳1ミリリットル脊髄）内に組織を移す。 Perfo氷の上のすべての更なるステップRM。 </li><li> 15分間インキュベートし、機械的にDounceホモジナイザーを用いて組織を均質化する。注意深く制御された均質化は、核がそのまま残ることを保証する必要がある。すべてのサンプルの比較可能性を確保するためにまったく同じように扱う。注：脳組織のために：しっかりフィット乳棒で5ストロークで組織を混乱させる。脊髄組織のために：しっかりフィット乳棒で5さらにストロークが続く遊嵌乳棒で5ストロークで混乱させる。 </li><li>トータルRNA単離のために-80℃で一定分量（脳と脊髄のための200μL400μL）、フラッシュ凍結して保存してください。 </li><li> 4℃で10分間、500×gでの遠心分離により核および未破砕の細胞及び組織断片を除去低速遠心分離は、リボソームの損失を防ぎます。 </li><li> NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの界面活性剤（1％の最終濃度まで各々）を加えることにより30分間核を含まない上清中で溶解する膜断片。 </li></ol><ol><li>このステップは、他の方法でポリリボソームプロファイルで信号をマスクするサンプルからの脂肪成分を除去する。まず、予備冷却超遠心バケット及び4℃でローターと2 M、1.1 Mを調製し、0.9 Mのショ糖溶液は、（ 表1参照）。 </li><li> 2 Mショ糖溶液の1.22倍容量の溶解液を混合し、ポリエチレン超遠心チューブに移す。 1.1 Mショ糖溶液で10mlを等量のすべてのチューブを埋める、その後0.9 Mショ糖溶液で慎重に重ねる。 </li><li>あらかじめ冷却超遠心バケットに超遠心管を配置します。 4℃、100,000×gで3時間遠心分離このプロセスの間に脂肪の成分が浮上し、上清中に残っているのに対し、ペレット内に堆積なるリボソーム。 </li></ol> 4。ショ糖勾配分画<ol><li>上清を除去し、均質化緩衝液Bでペレットを溶解する（ 表1を参照してください。 </st栄&gt;）。ナノドロップまたは同等の装置を用いて各サンプルの260nmでの吸光度を測定し、吸光度値に応じてロードする量を正規化する。 </li><li>あらかじめ冷却超遠心バケットに（準備が前のセクションで説明されている）、ショ糖勾配を配置します。慎重に勾配の上の層のサンプル。技術的なコントロールとして1ブランクのショ糖勾配を追加します。 </li><li>均質化バッファーで各バケットの重量を調整します。 4℃で285,000×gで1.5時間遠心分離器のサンプル</li><li>遠心分離の終了前にイスコの精留塔30分の準備を開始。分留塔の別のモデルが使用される場合、製造業者のプロトコルに従う。 <ol><li> UVランプのための適切な感度を（脳や脊髄のための0.05 AUFS 0.2 AUFS）を設定し、ウォームアップのためにそれをオンにします。チューブ穿孔を組み立て、管穿孔を通して60％ショ糖溶液にローリングポンプを介して接続してください。 </li><li>ショ糖（フローラットをポンピングすることによって設定をテストE：1ミリリットル/分）、特にグラデーションに気泡を導入する配管内の漏れがないことを確認してください。 </li><li>手動でUV検出器に勾配バッファをポンピングし、ベースラインを補正することにより、ブランクバックグラウンド吸収。 </li></ol></li><li>慎重にローターから沈降したサンプルを、ショ糖勾配を含む超遠心バケットを削除して、氷の上に置きます。解像度の損失を防ぐために、勾配の任意の突沸を避ける。 </li><li>分別装置で実行グラデーション。バックグラウンド吸収を評価し、適切な技術的なセットアップを確保するために、最初の空のグラデーションを実行します。 <ol><li> UV検出器にグラデーションを取り付け、チューブ穿孔してチューブの底に穴を開け。上向きにUV検出器を通過して落下ディスペンサーに沈降したサンプルでグラデーションを変位さ60％ショ糖のポンプを起動します。 </li><li> 260nmでの吸光度をsedimentaを示すピークが、試料の吸収プロファイルを生成するために文書化されてリボソームサブユニット、モノソーム、およびリボソームのその後増えに関連するmRNAのTiONから。 </li></ol></li><li> （2 mlチューブ内の600μlの各、）ドロップディスペンサーを経由して20分画にサンプルを収集。 </li></ol>個々の画分から5。RNA分離<ol><li>個々の画分1％の最終濃度まで10％SDSを添加し、タンパク質をアンフォールドし、リボソームを解離するために、よく混ぜる。この時点で、サンプルは-80℃で凍結させることができる対処すべき質問に応じて、画分を吸光度プロファイルに従ってプールすることができる。 </li><li>また、DNAの混入の痕跡を除去した酸性フェノール/クロロホルム抽出とRNAを単離する。 <ol><li>各試料から（RTに予熱）酸性フェノール/クロロホルムの1ボリュームを追加し、65℃で10分間の熱、その後ヒュームフードの下で圧力を解放します。 </li><li> RTで17000×gで20分間遠心サンプル。慎重に新しい1.5ミリリットルに水相を転送チューブ。水相は、遠心分離後の一番下にあるかもしれない、より高密度ショ糖画分における位相反転に注意してください。 </li><li> RNAを沈殿させるために、1容積のイソプロパノール、1/9体積酢酸ナトリウム（pH5.2）、各サンプルに1μlのグリコブルーを追加する。 -80℃でサンプルを少なくとも1時間を保つ</li><li> 17000×gで4℃で30分間遠心グリコブルーは、ペレットの可視化を提供します。上清を除去し、氷冷した80％エタノールと空気乾燥ペレットで一回ペレットを洗浄。 RNA分解酵素を含まない水でペレットを溶解する。 </li></ol></li><li>ナノドロップによるRNAの量を定量化し、バイオアナライザチップによってRNAの完全性を分析します。提示されたプロトコルで得られるRNAは、マイクロアレイと深い配列決定を含む当該技術分野ハイスループットアッセイのすべての状態に適している。 </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ポリリボソーム画は新しい技術ではありませんが、それは特に難しい1のまま。入力された材料に基づく、実質的な最適化が必要であることができる。これは、特に材料の量は、多くの場合、組織成分、翻訳mRNAの単離を妨げる制限および脂肪酸であるインビボ CNS試料の場合である。大部分の公開された分画プロトコルは、酵母または哺乳動物細胞株に対処する、および脳12,13,14のための確立されたプロトコルが存在する。これとは対照的に、脊髄の分別を記述する任意の出版物はほとんど存在しており、以前のプロトコルが15をプールするために多数の動物から脊髄を必要とする。これらの理由から、いくつかの本質的な修飾は、単一のマウス脊髄を含むCNS組織、分別のためのプロトコルを適合させるために行われた。シクロヘキシミドとリボソーム固定化は、ドゥリンリボソームの解離を避けるために、動物の灌流の間に実行されている組織抽出のG長いプロセス。続いて、ポリソームRNAはポリリボソームの収率を最大にするために特定の方法で抽出される。まず、ダウンシングによる組織の制御された均質化は、完全な核を保持し、DNAの混入を防ぐことができます。核はその後、遠心分離により確実に除去されている。洗剤NP-40およびデオキシコール酸ナトリウムの組み合わせは、小胞体およびその膜結合リボソームのリリースの溶解を保証します。また、脂質​​の豊富なミエリン内の紫外線吸収成分は、ポリリボソームプロファイルを不明瞭。ミエリン浮選は、必要があるようなポリリボソームのような密度の高い化合物は、ペレット化される場合、そのようなミエリンfloatとして軽量化化合物および16を除去した。ポリリボソームは、その後、17.5％〜50％のショ糖勾配上で沈降されています。代わりに、手動で各ショ糖層を積層し、凍結の、グラデーションも勾配ミキサーを用いて調製することができる。酸性フェノール/クロロホルムを用いて画分からのRNAの抽出を可能にするDNAは、最小限の損失でRNAを除去する。しかし、位相反転は（端数16以上）密なショ糖画分で行うことができる。 このプロトコルは、翻訳のレベルに取り組む他の従来の方法に比べて利点を提供します。例えば、リン酸化されたS6（著名な翻訳マーカー）の測定だけでなく、放射性同位元素で発生期の鎖のラベルの両方は、グローバルな翻訳レベルに関する情報を与えるが、特に翻訳されているものに少しを明らかにした。ポリリボソーム分画は、他の一方で、グローバルアセスメント翻訳だけでなくmRNAの翻訳および関連する調節タンパク質の同一性を可能にする。定量的リアルタイムPCRは、選択されたmRNAのうち迅速な読み取りのために単離されたRNA上で行うことができ、マイクロアレイおよび次世代のRNA配列決定は、ゲノムワイド研究のために行うことができる。ここに提示の最適化は、技術が減少するので、CNS組織の最小量で使用することを可能にする必要な動物の数をINGと組織処理時間を短縮することにより、全体的な実験の品質を向上させる。一方、この技術は、翻訳したものからのもの停止状態のリボソームを区別することができない。ストールしたリボソームを運ぶ転写物は、重質留分に沈降し、データを解釈する際に留意すべきである。 リボソームは、細胞型特異的な様式でそれぞれのエピトープタグまたはレポーターで標識し、免疫沈降17,18により単離したmRNAを対応付けた最近報告された技術、すなわちRiboTaqおよびTRAPがあります。この技術は、特定の細胞集団のために読み出さ高い分解能を提供するために分別ポリリボソームに結合することができる。リボソームフットプリントはリボソームによって保護されているmRNAの別の新規な小断片を生成するために、ヌクレアーゼ消化を伴う技法、または「フットプリント」である。ライブラリは、これらの足跡から生成され、配列決定される。このメソッドはPROVIDEの翻訳に対するコドン特異的全ゲノム解析やストールリボソームを識別することができる、非-AUGコドンとポリリボソーム分別19により達成することができない小さな上流のオープンリーディングフレームを開始。しかしながら、ポリリボソーム分画は、高純度の試料がしばしば必要とされるライブラリーを調製するために必要な分子種を富化、単リボソームを含有する消化された断片の単離のためのプロファイリングリボソームに結合することができる。一緒になって、ポリリボソーム分画は、永続的な重要性を持つ柔軟な方法であり、次世代シーケンシングのようなゲノムワイドアッセイを含む、様々なダウンストリームアプリケーションに接続することができる。

遺伝子発現は、翻訳は最も優勢な効果軸受1と、転写、翻訳およびmRNAおよびタンパク質の安定性の複合作用によって決定される。なお、これらのステップの各々は高度に調節されていることが今や明らかである。マイクロRNAは、RNA顆粒、代替のポリアデニル化および細胞質の形成は、遺伝子発現2,3の転写後調節のいくつかの例である。これらの機構の各々は、翻訳からの転写を脱共役し、関心のある生物系においてプロテオームに影響を与えます。従って、当然、単独でmRNAレベルは、タンパク質レベル4の不完全読み出される。定量的プロテオミクスは、しかし最近の進歩にもかかわらず、感度、タンパク質配列の解決にかなりの制限がまだある、遺伝子発現の最も直接的な評価を提供する。したがってtranslatomeに取り組む、翻訳mRNAのレパートリーは、勉強の間の優れた妥協点を提供していますトランスクリプトームやプロテオーム。これは、最終的な遺伝子発現を評価するトランスクリプトミクスよりも正確で、より高いカバレッジとプロテオミクスよりもシーケンスの解像度の両方を提供します。 哺乳動物系では、翻訳事象の大部分は、キャップ依存性開始介して開始する。一緒に40Sリボソーム小サブユニットと真核生物の開始因子群は、mRNAの5 &#39;キャップに集合。複合体は、mRNAをスキャンして、開始コドンAUGに到達すると、完全な80Sリボソーム形成するために、60Sリボソーム大サブユニットを募集しています。リボソームは伸長因子は、新生ペプチド鎖に装填されたtRNAのアミノ酸の組み込みを補助するとは、mRNAに沿って移動すると伸長段階に進む。複数のリボソームは同時に単一のmRNAに沿って進むことができ、関連するリボソームの数は、タンパク質合成5,6の速度と相関することが示されている。これはTRANのための信頼できる指標をロードするリボソームを作るslation積極的に沈降速度に基づいてmRNAを翻訳するの分離を可能にする。のmRNAの翻訳の定量化に加えて、配列情報は、翻訳調節に関与するモチーフを同定するために得ることができる。また、RNA結合タンパク質および他の翻訳因子は、関連する調節タンパク質の研究および発見を容易にする、異なる画分から単離することができる。 神経系において、翻訳制御は、mRNAの貯蔵、輸送および局所タンパク質合成のようなプロセスに関連している。成長円錐は、軸索7の他の部分とは異なるmRNAの特定のローカライズされたプールを保有することが示されている。また、軸索は局所的にタンパク質8,9を合成する能力を有する。その結果、翻訳の局所制御は、神経生物学の研究の重要な話題になっている。これに対処するポリリボソーム分画の電位に技術が使用された、いくつかの研究で例示されている脊髄開発における軸索ガイダンスを調査し、脳10,11におけるBDNFの活性依存性の翻訳を示した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

複数のプロセスは、mRNAおよびタンパク質の転写、翻訳および安定性を含む遺伝子発現に関与している。これらのステップの各々は、緊密に、タンパク質存在量の最終的な動力学に影響を与え、調節される。種々の調節機構は、単独で、遺伝子発現の信頼できないインジケータをmRNAレベルを描画、変換ステップに存在する。また、mRNAの翻訳のローカル規制は特に神経生物学での注目の的に「translatomics」をシフトする、神経機能に関与している。提示方法は、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクスをブリッジするために使用することができる。 ここでは、複数のリボソームとショ糖勾配での差動沈降に積極的に翻訳されたmRNAの関連付けに基づいてtranslatomeに質問​​ポリリボソーム分画の技術に不可欠な変更について説明します。伝統的に、特にセントラのin vivoサンプルでの作業lの中枢神経系（CNS）、材料の制限された量および脂肪組織成分の存在のために困難なことが証明されている。これに対処するために、記載されたプロトコルは、特に単一のマウス脊髄および脳の使用によって実証されるように、CNS材料の最小量で使用するために最適化される。簡単に説明すると、CNS組織を抽出し、翻訳をリボソームとmRNAのシクロヘキシミド上に固定化される。ミエリン浮選は、その後、脂質リッチ成分を除去する。分別はmRNAは、そのリボソームの負荷に応じて分離してショ糖勾配上で実行される。単離された画分を新たなゲノムワイドなアッセイ技術を含む下流のアッセイの範囲に適している。

図2は、分別後の代表ポリリボソームプロファイルを示す。細胞株について前述したように脳と脊髄のプロフィールは、特徴的な吸収曲線を示す。小さなリボソームサブユニット（40S）より軽い留分で沈殿物とに結合されたmRNAは、リボソーム大サブユニット（60S）とモノソーム（80S）が結合されたmRNAが続くのプロファイル上のピークとして最初に表示されます。複数のリボソームに結合したmRNAは、後ピークがバインドされたリボソームの増加数を示すとともに、重い画分で沈降する。グローバル翻訳プロファイルから評価することができる。一例として、脳組織は、よりアクティブな変換を示し、脊髄組織よりも比を高くするモノソームポリリボソームを有する。 個々の画分から抽出されたRNAは、18Sおよび28S rRNAの分布を示す、バイオアナライザにより評価した。 18S rRNAのライターsucrに沈降小さなリボソームサブユニットによると、以前のプロフィールに表示されます<html> OSE画。全RNAの典型的な収量は、脳と脊髄のための2-4μgの10〜20μgのです。個々の画分からのRNA収量は、割合に応じて、それぞれ4μgの、脳と脊髄のための0.8μgのまである。ブランクスクロース勾配は既にDTTの存在に起因する260nmでのいくつかのバックグラウンド吸収を示す。このバックグラウンドは、サンプル値を正規化するために、データ分析時に減算することができる。 EDTA処理は沈降プロファイルが翻訳によるもの実証、ポリリボソームピークを崩壊した。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。ワークフローおよびin vivoでのポリリボソーム画の潜在的なアプリケーション。&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> 空のグラデーションと脳の図2。バイオアナライザによる抽出されたRNAの評価と脳と脊髄の（A）の代表的なポリリボソームプロファイル、。定量RT-PCRによる分画上のGAPDH mRNAの（B）の分布。（C）ポリリボソームプロファイルとないEDTA処理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2X勾配バッファ</td><td> 30mMのトリス-HCl pH7.4中、30のMgCl 2、600mMのNaCl、20mMの0μg/ mlのシクロヘキシミド（CHX）、2mMのジチオスレイトール（DTT） </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液17.5％ </td><td> 8.67グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液25.6％ </td><td> 12.8グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液33.8％ </td><td> 16.9グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液41.9％ </td><td> 20.95グラムのスクロース、25ミリリットル2X勾配バッファ、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td>スクロース溶液、50％ </td><td> 25gのスクロース25mlの2×勾配緩衝液、最大50ミリリットルのDEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td>均質化緩衝液A </td><td> 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4）で、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 200μg/ mlのCHX、1Xロシュ完全プロテアーゼ阻害剤、1mMのDTT、1mMのphenylmethanesulfonylfluoride（PMSF）、100 U / mlののRNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2Mショ糖溶液</td><td> 68.4％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1Mショ糖溶液</td><td> 38.5％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9Mショ糖溶液</td><td> 30.8％スクロース、50mMトリス-HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを</td><td> 100μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> HomogenizationバッファB </td><td> 0.25 Mスクロース、50mMのトリス/ HCl、pH7.4中、5mMのMgCl 2、25mMのKClを、1％NP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム</td><td> 200μg/ mlのCHX、1×ロッシュ完全プロテアーゼインヒビター、1mMのDTT、1mMのPMSF、100 U / mlでのRNAsin </td></tr></tbody></table>表1。 緩衝液および溶液のリスト。

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K ビュー.  German Cancer Research Center (DKFZ). このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。 

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

視神経切断：中枢神経系における成人ニューロンのアポトーシスのモデル

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

神経科学

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...