このプロトコルは、DNAとリガンド間の分子間結合を研究するためのハイスループット技術を提供します。この技術は、生体分子構造の膨大なセットの調査において高いスループットを実証しています。これは、個々の分子の機械的化学的性質を分子アンサンブルの化学的性質に変換することによって行われます。
これは非常に前進した実験だと思いますが、批判的なステップはほとんどありません。例えば、顕微鏡、ホモジナイザー、反応管等の位置合わせが挙げられる。蛍光の変化を正確に追跡するには、これら3つのものを完全に整列させる必要があります。
ホモジナイザーと顕微鏡を取り付けテーブルに組み立てることから始めます。ゴーグルを着用した後、蛍光顕微鏡の電源を入れ、ホモジナイザーを調整して、励起光ビームがホモジナイザーの分散先端の中心を通過することを確認します。次に、高さ5センチメートル、断面1.5 x 1.5平方センチメートルの平底反応チャンバーを準備し、選択したチャンバー材料が蛍光を発してバックグラウンドを減少させないようにします。
その後、反応チャンバーを蛍光顕微鏡のサンプルステージにクランプし、チャンバーを調整してホモジナイザーの分散チップを保持し、チップが反応チャンバーの底面よりわずかに上になるようにします。次に、ホモジナイザーとチャンバーの垂直位置を一緒に調整して、顕微鏡の焦点が分散チップの表面にあることを確認します。次に、分散チップの水平位置を調整して、検出領域がローターとステーターの間に設定されていることを確認します。
実験で使用した蛍光色素に従って、蛍光チャネルをオンにします。高速せん断実験の前に、脱イオン水を使用して、低いせん断速度でせん断をテストしました。まず、原稿に記載されているように、脱イオン水中でそれぞれ色素とその両末端に消光物質で標識したヒトテロメアiモチーフDNAを調製する。
次に、pH 5.5またはpH 7.4の30ミリモルMESバッファーでDNAを5マイクロモルに希釈します。DNA溶液に、0〜60マイクロモルの濃度範囲のリガンドL2H24OTD」を加え、溶液を10分間穏やかに混合して、光なしでi-モチーフ構造を折り畳みます。せん断なしで蛍光顕微鏡を使用して、脱イオン水で満たされた反応チャンバーのバックグラウンド蛍光強度を確認し、最小限に抑えます。
次に、ソフトウェアを使用してCCDカメラのパラメータを露出時間を0.5秒、CCD感度を1, 600、記録時間を20分に設定します。長いピペットを使用して、DNA溶液を空の清潔な反応チャンバーに加え、反応チャンバーをブラックボックスで覆います。次に、ホモジナイザーを起動して、CCDカメラをオンにしてデータを記録し、毎秒9, 724から毎秒97, 245の範囲の選択されたせん断速度で20分間せん断を実行します。
実験後、チャンバーを取り外し、脱イオン水で洗浄します。i-motif DNAと脱イオン水を調製します。次に、10マイクロモルのi-motifDNAと300マイクロモルの塩化第二銅と300マイクロモルのアスコルビン酸を添加した30ミリモルのトリス緩衝液を10分間インキュベートし、i-モチーフ構造をフォールディングします。
次に14の遠心力で限外ろ過装置で溶液を超濾過し、300倍G.各濾過後に300マイクロモルのアスコルビン酸を添加した30ミリモルのトリス緩衝液で溶液を約500マイクロリットルに補充する。残留溶液を回収した後、300マイクロモルのアスコルビン酸を添加した30ミリモルのトリスと、20マイクロモルのCalFluor 488アジド、20マイクロモルのHPG、および10マイクロモルのTBTAを加えて、最終容量300マイクロリットルを作成します。試薬を加えたら、溶液を暗室に移動します。
次に、せん断実験の前に顕微鏡を使用して、脱イオン水で満たされた反応チャンバーのバックグラウンド蛍光強度を確認し、最小化します。次に、DNA溶液を長いピペットで空の反応チャンバーに加え、CCDカメラの電源を入れた状態で20分間、毎秒63、209のせん断速度でホモジナイザーせん断を開始します。実験後、チャンバーを取り外し、脱イオン水で洗浄します。
i-motif DNAの蛍光強度は、pH 5.5 MES緩衝液中で毎秒9, 724から毎秒97, 245の範囲の純粋な速度で増加することが観察された。しかし、同じi-motif DNAを毎秒63, 209の速度で剪断すると、MESバッファー中のpH 7.4ではフォールディングされないため、蛍光強度は増加しませんでした。純粋な流れにさらされたDNA i-motif分子へのリガンド結合を評価し、蛍光強度の増加がリガンド濃度の増加とともに明白ではなくなったことを示しました。
リガンドとi-motifとの相互作用について解離定数を決定したところ、34マイクロモルであることが判明した。銅1キレートi-motifは毎秒63, 209のせん断速度で展開され、放出された銅1は蛍光クリック反応を引き起こし、時間の経過とともに蛍光強度が増加しました。まず、検出領域がローターとステーターの間に設定されていることを確認します。
次に、蛍光バックグラウンドを確認して最小化します。そして最後に、クリック反応を実行する前に、必ず反応をフィルタリングしてください。この方法は、あらゆる種類のポリマーを折りたたんだり広げたりして、機械的強度を探求するための入り口を開きます。
それは、他のDNA構造、タンパク質、または他のポリマー、および他の種類の分子との相互作用である可能性があります。前述のように、このアプローチを使用して他のいくつかの高分子を研究することができます。
