<ol>
	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

正しく完了したら、このプロトコルで説明されているアッセイは、反対脱顆粒およびHIV - 1感染細胞を（図5を参照）溶解するNK細胞の能力の代表的な画像を提供する必要があります。 HIV感染細胞とNK細胞の溶解、HIV感染細胞への応答におけるNK細胞の脱顆粒は10に直接比例しているべきです。 HIV感染細胞に細胞毒性応答を測定するには、2つのNK細胞の機能アッセイのための信頼性の高い結果が非常にNK細胞だけでなく、感染細胞の高度に精製された人口の精製分離に依存しています。 NK細胞とHIV - 1感染細胞を精製したことは、細胞率を目標とし、かなり正確なエフェクターを達成するための非常に重要です。同様に、標的細胞集団から死とアポトーシス細胞の除去は、エフェクター細胞との51 Cr標識またはインキュベーションの前に重要です。 の51 Crの同位体標識のステップ中に死亡またはアポトーシス細胞の存在とアポトーシスを起こした細胞によって内在化されることがあります高い自発リリースになりますし、計算された％特異的溶解が歪みます。また、死またはアポトーシス細胞の存在は、CD107aの発現の異常に高​​いレベルで、その結果、NK細胞の脱顆粒を引き起こすことがあります。各レプリケートから削除上清の量の違いがよく高い標準偏差につながるとして、51 Cr放出アッセイにおけるNK細胞と標的細胞のインキュベーション後の細胞フリー上清を除去する際に正確なピペッティングが必要です。変更は、特定の受容体またはリガンド6,11への敵対的抗体との共培養の前にエフェクターや目標をインキュベートすることにより、HIV感染細胞のNK細胞の溶解をトリガーに特定のNK受容体の役割を評価するために、これらのプロトコルに行うことができます。サイトカイン処理したNK細胞（例えば、IL - 2、IL - 15）刺激NK細胞が12の機能を評価するために使用することができます。同様に、抗体依存細胞毒性アッセイは、これらのプロトコルを用いて行うことができる。抗HIV抗体は（例えば、抗gp120の）NK細胞の低親和性のFc受容体CD16 13により認識のための標的細胞に添加することができます。これらのアッセイは、HIV感染細胞に対するNK細胞の細胞傷害性応答を測定するための設定が、また、HIV感染細胞の認識を以下のサイトカインを産生するNK細胞の能力を測定するように変更することができます。我々はこのプロトコルでは、標的細胞として、in vitroで感染した細胞の使用を説明したが、我々は最近、HIVに感染した患者から標的細胞の生成を説明してきました。これは、インターロイキン-2 11の存在下でマイトジェンで刺激後2週間にわたって細胞の拡大が続くCD4 + T細胞の分離を必要とします。拡張の2週間後、この資料に記載されているプロトコルは、標的細胞を単離するために使用されています。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

ナチュラルキラー（NK）細胞はウイルス感染細胞に対する自然免疫応答の重要なコンポーネントです。 HIV感染細胞に対するNK細胞の機能で任意のaberrancyを識別することが潜在的にそれらの細胞溶解活性を増強する治療法につながる可能性があるため、HIV - 1感染細胞を認識し、溶解するNK細胞の能力を理解することが重要です。ではなく、標的細胞としてのHIV感染の主なT細胞の芽球細胞毒性アッセイで感染- T -細胞のラインを使用する必要があります。 T -細胞株は、さらに感染することなく、NK細胞溶解に非常に敏感です。さらに、溶解をもたらす標的とエフェクター細胞の間に主要組織適合遺伝子複合体クラスIのミスマッチを防ぐために、自家一次電池を使用する必要があります。主なHIV感染細胞に対するNK細胞の細胞溶解反応を評価した初期の研究では、感染細胞の1,2の重要な殺害を示すことはできなかった。しかし、NK細胞の機能的アッセイで標的細胞として、一次T細胞のHIV - 1感染を使用すると、非感染細胞3を汚染する原因が存在することは困難であった。非感染細胞の比率にこの矛盾した感染細胞は、ドナーNK細胞機能の変動が原因ではないかもしれないサンプル間のNK細胞死滅の変化になります。従って、それは実験3,4の間に細胞の比率を標的とするエフェクターを標準化するために精製された感染した細胞集団で作業することが有益であろう。ここでは、死んでいるまたは死にかけている細胞の3-6を削除するには、感染した細胞や市販キットの利用可能性にダウンモジュレートCD4するHIV - 1の能力を活用することによって、HIV - 1感染細胞の高度に精製された人口の分離を示しています。精製された感染した一次T細胞の芽球は、5月7日エフェクター人口としてNK細胞を精製した脱顆粒や細胞毒性アッセイのいずれかでターゲットとして使用できます。脱顆粒アッセイにおけるエフェクターとしてNK細胞の使用は、8は &quot;細胞傷害性顆粒&quot;と呼ばれる特殊なリソソームの溶菌内容を解放するNK細胞の能力を評価します。 CD107a、細胞溶解性顆粒が形質膜に融合するNK細胞表面に発現してなるリソソーム膜タンパク質に対する蛍光標識抗体で染色することによって、我々は、細胞認識をターゲットに反応して脱顆粒、NK細胞の何パーセントを決定することができます。また、NK細胞溶解活性は、NK細胞の存在下で標的細胞内からの51 Crの放出により溶解標的細胞の割合の決定を可能にする細胞傷害性アッセイで評価することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays at JoVE.com

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

HIV感染細胞にナチュラルキラー細胞溶解反応を測定するために細胞毒性のアッセイは、標的細胞の純度によって制限されます。ここでは、CD4をダウンモジュレートするHIV - 1の能力を活用することにより、HIV - 1感染の主なT細胞芽球の高度に精製された人口の分離を示しています。

ナチュラルキラー細胞傷害性アッセイにおけるHIV - 1感染プライマリCD4 + T細胞を標的細胞としての準備と使用

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.7K ビュー.  Rush University Medical Center. HIV感染細胞にナチュラルキラー細胞溶解反応を測定するために細胞毒性のアッセイは、標的細胞の純度によって制限されます。ここでは、CD4をダウンモジュレートするHIV - 1の能力を活用することにより、HIV - 1感染の主なT細胞芽球の高度に精製された人口の分離を示しています。