<ol>
	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

Doğru yapıldığı zaman bu protokolü açıklanan Testler karşı degranüle ve HIV-1 enfekte olmuş hücreleri (bkz. Şekil 5) lyse NK hücreleri yeteneğini temsil eden bir resim sağlamalıdır. HIV ile enfekte olan hücreleri ve NK hücreleri lizis HIV ile enfekte olan hücreleri yanıt NK hücre degranülasyonu 10 doğru orantılı olmalıdır. HIV ile enfekte hücreleri sitotoksik tepkilerini ölçmek için iki NK hücre fonksiyonel testleri için güvenilir sonuçlar son derece NK hücrelerinin yanı sıra, son derece saf bir nüfusun enfekte hücreleri saflaştırılmış izolasyonu bağlıdır. Saflaştırılmış sahip NK hücreleri ve HIV-1 ile enfekte hücreler oldukça doğru efektör hücre oranı hedefi, başarı için kritik öneme sahiptir. Benzer şekilde, ölü ve apoptotik hücreleri hedef hücre popülasyonlarının kaldırılması efektör hücreleri ile 51 Cr etiketleme veya inkübasyon öncesinde önemli 51 Cr izotop etiketleme adım sırasında ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı olarak apoptoz gören hücreler tarafından içselleştirilmiş olabilir yüksek spontan sürümde neden olacak ve hesaplanan% özel lizis bozar. Ayrıca, ölü ya da apoptotik hücrelerin varlığı, CD107a ifade anormal derecede yüksek düzeyleri NK hücre degranülasyonu tetikleyebilir. Hassas pipetleme 51 Cr serbest tayinlerde, NK hücreleri ve hedef hücrelerin kuluçka aşağıdaki hücre süpernatantlar çıkarırken, gerekli her çoğaltmak kaldırıldı süpernatant hacmi farklılıkları gibi yüksek standart sapma neden olacaktır . Değişiklikler önce belirli reseptörleri veya ligandlar 6,11 antagonist antikorlar ile ko-kültür effektör veya hedefleri kuluçka NK hücreleri, HIV ile enfekte olan hücreleri lizis tetiklenmesi belirli NK reseptörleri rolünü değerlendirmek için bu protokoller yapılabilir . Sitokin tedavi edilen NK hücreleri (örneğin, IL-2, IL-15), NK hücreleri uyarılır 12 işlevselliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, bu protokolleri kullanarak antikor bağımlı hücre sitotoksisite testleri yapılabilir. Anti-HIV antikorların (örneğin, anti-gp120), NK hücre düşük afinite Fc reseptörü CD16 13 tarafından tanınması için hedef hücrelere eklenebilir . Bu deneyleri, HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitotoksik tepkileri ölçmek için kurulmuş olmasına rağmen aynı zamanda NK hücreleri, HIV ile enfekte hücre tanıma aşağıdaki sitokin üretme yeteneğini ölçmek için modifiye edilebilir. Biz bu protokolü in vitro enfekte olan hücreleri hedef hücreler olarak kullanımı tanımlanmış olsa da biz son nesil açıklanan hedef hücrelerin HIV ile enfekte olan hastaların var . Bu izolasyon CD4 + T-hücrelerinin hücrelerin genişlemesi, interlökin-2 (11) varlığında mitojenler ile uyarılmasını takiben bir iki hafta boyunca takip gerektirir. Genişleme iki haftalık bir süre sonra, bu makalede anlatılan protokoller hedef hücreleri izole etmek için kullanılır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

Doğal öldürücü (NK) hücreleri, virüsle enfekte olan hücreleri doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hayati bir bileşendir. NK hücreleri, HIV ile infekte hücrelere karşı NK hücre fonksiyonu herhangi bir anormallik tespit, çünkü potansiyel olarak kendi sitolitik aktivitesini artıracak tedavilere yol açabilir HIV-1 enfekte hücreleri tanıma ve lyse yeteneğini anlamak için önemlidir. HIV ile enfekte olan birincil T-hücre patlamalar ziyade hedef hücreleri sitotoksisite deneyleri enfekte T-hücre hatları kullanmak için bir ihtiyaç vardır. T-hücre, hatta enfeksiyon olmadan, NK hücre lizis oldukça duyarlıdırlar. Ayrıca, hedef ve effektör hücre lizis neden olacaktır arasında uyumsuzlukları büyük doku uygunluk kompleksi sınıf önlemek için otolog birincil hücreler kullanmak için gerekli. Primer HIV ile enfekte olan hücreleri NK hücre sitolitik yanıtları değerlendiren ilk çalışmalar, enfekte olmuş hücreleri 1,2 önemli öldürme göstermek için başarısız oldu . Ancak, kullanarak, HIV-1 enfekte birincil NK hücre fonksiyonel analizde hedef hücreler olarak T hücreleri enfekte olmamış hücrelerdeki 3 kontamine varlığı nedeniyle zor olmuştur. Bu tutarsız enfekte hücrenin bulaşmamış hücre oranı donör NK hücre fonksiyonunu değişkenliği nedeniyle olmayabilir örnekleri arasında NK hücre öldürme varyasyon neden olacaktır. Bu nedenle, deneyler arasındaki hücre oranları 3,4 hedef efektör standardize etmek amacıyla bir saflaştırılmış enfekte hücrenin nüfusu ile çalışmak faydalı olacaktır. İşte biz, ölü ya da ölmekte olan hücrelerin 3-6 kaldırmak için, HIV-1 yeteneğini enfekte olmuş hücreleri ve ticari kitleri durumu aşağı modüle CD4 yararlanarak HIV-1 enfekte olmuş hücreleri, son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir. Saflaştırılmış enfekte birincil T-hücre patlamalar sonra nüfus olarak 5-7 efektör NK hücreleri saflaştırılmış bir degranülasyonu veya sitotoksik tahlil ya da hedef olarak kullanılabilir. NK hücreleri degranülasyonu tayininde effektör olarak kullanın 8 &quot;sitolitik granül&quot; olarak adlandırılan uzman lizozomlar litik içeriğini serbest bırakmak için bir NK hücre yeteneğini değerlendirir. Florokrom CD107a sitolitik granül plazma membranına sigorta NK hücre yüzeyinde eksprese olan bir lizozomal membran proteini karşı konjuge antikor ile boyanarak hücre tanıma hedef yanıt degranüle NK hücrelerinin yüzde belirleyebilirsiniz. Alternatif olarak, NK hücre litik aktivite, hedef hücreleri, NK hücreleri varlığı hedef hücre içinde 51 Cr salınımı ile parçalanmış yüzdesi tayini için izin veren bir sitotoksik tayininde değerlendirilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays at JoVE.com

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Sitotoksisite deneyleri, HIV bulaşmış hücrelerin doğal öldürücü hücre litik tepkileri ölçmek için hedef hücreler saflığı ile sınırlıdır. Biz burada, HIV-1 yeteneğini CD4 aşağı modüle yararlanarak HIV-1 ile enfekte birincil T-hücre patlamaların son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir.

Hazırlanması ve kullanımı, HIV-1 Enfekte İlköğretim CD4 + T-Hücreleri Hedef Hücreler olarak Natural Killer Hücre Sitotoksik Tahliller

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.8K Görüntüleme.  Rush University Medical Center. Sitotoksisite deneyleri, HIV bulaşmış hücrelerin doğal öldürücü hücre litik tepkileri ölçmek için hedef hücreler saflığı ile sınırlıdır. Biz burada, HIV-1 yeteneğini CD4 aşağı modüle yararlanarak HIV-1 ile enfekte birincil T-hücre patlamaların son derece saf bir nüfusun izolasyon göstermektedir.