<ol>
	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

Wenn es richtig gemacht die Tests in diesem Protokoll beschriebenen sollte ein repräsentatives Bild der NK-Zellen die Fähigkeit, gegen degranulieren und lysieren HIV-1 infizierten Zellen (siehe Abbildung 5). NK-Zell-Degranulation in Reaktion auf HIV-infizierten Zellen und der NK-Zellen Lyse HIV-infizierten Zellen sollten direkt proportional 10. Zuverlässige Ergebnisse für die beiden NK-Zell-funktionellen Assays, zytotoxische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen sind abhängig von der Isolierung von hochreinem NK-Zellen sowie ein hochreines Bevölkerung von infizierten Zellen. Nachdem gereinigt NK-Zellen und HIV-1 infizierten Zellen sind von entscheidender Bedeutung für die Erreichung der eine ziemlich genaue Effektor-Verhältnisses Ziel. Ebenso ist das Entfernen von toten und apoptotischen Zellen aus dem Ziel-Zell-Populationen vor 51 Cr Kennzeichnung oder der Inkubation mit den Effektorzellen wichtig. 51 Cr kann durch Zellen, die Apoptose sind als das Vorhandensein von toten oder apoptotischen Zellen während der Isotopenmarkierung Schritt verinnerlicht werden wird in eine hohe spontane Freisetzung führen und den berechneten% spezifische Lyse zu verzerren. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von toten oder apoptotischen Zellen auslösen NK-Zell-Degranulation was zu ungewöhnlich hohen CD107a Ausdruck. Präzise Pipettieren ist notwendig, wenn das Entfernen der zellfreien Überstände nach der Inkubation von NK-Zellen und Zielzellen in der 51 Cr-Release Assays, da die Unterschiede in der Lautstärke der Überstand aus jeder Wiederholung entfernt und wird in hohen Standardabweichungen führen. Änderungen können auf dieser Protokolle vorgenommen werden, um die Rolle spezifischer NK-Rezeptoren bei der Auslösung von NK-Zellen die Lyse von HIV-infizierten Zellen durch Inkubation der Effektoren oder Ziele vor Co-Kultur mit antagonistischen Antikörpern an spezifische Rezeptoren oder Liganden 6,11 zu bewerten. Zytokin-behandelten NK-Zellen (zB IL-2, IL-15) kann verwendet werden, um die Funktionalität der stimulierten NK Zellen 12 zu bewerten. In ähnlicher Weise können Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität erfolgt über diese Protokolle werden. Anti-HIV-Antikörper (zB Anti-gp120) an den Zielzellen für die Erkennung durch die NK-Zelle mit niedriger Affinität Fc-Rezeptor CD16 13 hinzugefügt werden. Diese Assays, obwohl bis zu NK-Zelle zytotoxische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen, kann auch geändert werden, um die Fähigkeit der NK-Zellen, Zytokine zu folgenden HIV-infizierten Zelle Anerkennung produzieren zu messen. Obwohl wir in diesem Protokoll beschrieben die Verwendung von in vitro infizierten Zellen als Zielzellen haben wir kürzlich die Erzeugung von Ziel-Zellen von Patienten mit HIV infiziert beschrieben. Dies erfordert die Isolierung von CD4 + T-Zellen durch Ausdehnung der Zellen über einen Zeitraum von zwei Wochen nach Stimulation durch Mitogene in Anwesenheit von Interleukin-2 11 gefolgt. Nach der zweiwöchigen Periode der Expansion werden die Protokolle in diesem Artikel beschrieben wird verwendet, um die Zielzellen zu isolieren.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunantwort auf Virus-infizierte Zellen. Es ist wichtig, die Fähigkeit der NK-Zellen zu erkennen und zu lysieren HIV-1 infizierten Zellen, weil die Identifizierung jeder aberrancy in NK-Zell-Funktion gegen HIV-infizierten Zellen könnte möglicherweise zu Therapien, die ihre zytolytische Aktivität zu erhöhen führen würde verstehen. Es ist notwendig, um HIV-infizierte primäre T-Zell-Blasten als Zielzellen eher dann infizierten-T-Zell-Linien in der Zytotoxizitätsassays verwenden. T-Zell-Linien, auch ohne Infektion, sind sehr anfällig für NK-Zell-Lyse. Darüber hinaus ist es notwendig, autologe primäre Zellen verwenden, um Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I Diskrepanzen zwischen Soll-und Effektor-Zelle, in Lyse Ergebnis zu verhindern. Frühe Studien, die NK-Zelle zytolytische Antworten auf primären HIV-infizierten Zellen keine signifikanten Abtötung der infizierten Zellen 1,2 zeigen. Allerdings mit HIV-1 infizierten primären T-Zellen als Zielzellen in NK-Zellen funktionelle Assays wurde schwierig, da das Vorhandensein von kontaminierenden nicht infizierten Zellen 3. Dieser Widerspruch infizierten Zelle zu Zelle infiziert Verhältnis wird in Variation in NK-Zellen töten zwischen den Proben, die möglicherweise nicht durch Schwankungen in Spender NK-Zell-Funktion führen. So wäre es von Vorteil sein, mit einer gereinigten infizierte Zellpopulation zu arbeiten, um den Effektor zu standardisieren, um Zell-Verhältnissen zwischen 3,4 Experimente Ziel. Hier zeigen wir die Isolierung eines hochgereinigten Bevölkerung von HIV-1 infizierten Zellen durch die Nutzung von HIV-1 die Fähigkeit down-Modulation CD4 auf infizierten Zellen und die Verfügbarkeit von kommerziellen Kits zu entfernen tote oder sterbende Zellen 3-6. Das gereinigte infizierten primären T-Zell-Blasten können dann als Ziele entweder in einer Degranulation oder zytotoxische Assay mit gereinigten NK-Zellen als Effektor-Population 5-7 verwendet werden. Verwendung von NK-Zellen als Effektoren in einer Degranulation Test bewertet die Fähigkeit eines NK-Zellen, die lytische Inhalte spezialisiert Lysosomen 8, genannt &quot;zytolytische Granulat&quot; freizugeben. Durch Färbung mit einem Fluorochrom konjugierte Antikörper gegen CD107a, eine lysosomale Membranprotein, ausgedrückt auf der NK-Zell-Oberfläche, wenn die zytolytische Granulat zur Plasmamembran verschmelzen wird, können wir bestimmen, welcher Prozentsatz der NK-Zellen degranulieren in Reaktion auf Zell-Erkennung Ziel. Alternativ können NK-Zell-lytischen Aktivität in einem zytotoxischen Assay, dass für die Ermittlung des Prozentsatzes der Zielzellen durch Freisetzung von 51 Cr aus der Zielzelle in Gegenwart von NK-Zellen lysiert ermöglicht ausgewertet werden.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Zytotoxizitätsassays auf natürlichen Killerzellen lytische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen ist durch die Reinheit der Zielzellen beschränkt. Wir zeigen hier die Isolierung eines hochgereinigten Bevölkerung von HIV-1 infizierten primären T-Zell-Blasten durch die Nutzung von HIV-1 s Fähigkeit, down-Modulation CD4.

Herstellung und Verwendung von HIV-1 infizierten primären CD4 + T-Zellen als Zielzellen in der natürlichen Killerzellen Zytotoxische Assays

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.7K Aufrufe.  Rush University Medical Center. Zytotoxizitätsassays auf natürlichen Killerzellen lytische Reaktionen auf HIV-infizierten Zellen zu messen ist durch die Reinheit der Zielzellen beschränkt. Wir zeigen hier die Isolierung eines hochgereinigten Bevölkerung von HIV-1 infizierten primären T-Zell-Blasten durch die Nutzung von HIV-1 s Fähigkeit, down-Modulation CD4.