<ol>
	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Se fatto correttamente il test descritti in questo protocollo dovrebbe fornire un quadro rappresentativo della capacità delle cellule NK di degranulano contrari e lisare HIV-1 cellule infette (vedi Figura 5). Degranulazione delle cellule NK in risposta ad infezione da HIV delle cellule e le cellule NK lisi cellule infettate da HIV dovrebbe essere direttamente proporzionale 10. Risultati affidabili per i due test funzionale delle cellule NK di misurare le risposte citotossiche per le cellule infettate da HIV dipendono l&#39;isolamento delle cellule NK altamente purificato, nonché una popolazione altamente purificata delle cellule infette. Dopo aver purificato le cellule NK e HIV-1 le cellule infettate sono fondamentali per il raggiungimento di un effettore abbastanza preciso bersaglio rapporto cellulare. Allo stesso modo, la rimozione delle cellule morte e dalle popolazioni di cellule apoptotiche l&#39;obiettivo è importante prima di 51 Cr etichettatura o l&#39;incubazione con le cellule effettrici. 51 Cr possono essere internalizzati dalle cellule che sono in fase di apoptosi come la presenza di cellule morte o apoptosi durante la fase di etichettatura isotopo si tradurrà in un comunicato alta spontaneo e distorcere la lisi% calcolato specifici. Inoltre, la presenza di cellule morte o apoptosi può scatenare la degranulazione delle cellule NK con conseguente livelli anormalmente elevati di espressione CD107a. Pipettaggio preciso è necessario quando si rimuove la cellula senza sopranatanti dopo l&#39;incubazione delle cellule NK e cellule bersaglio nei 51 saggi rilascio Cr, come le differenze nel volume del sopranatante rimosso da ogni replica e si tradurrà in alto deviazioni standard. Modifiche possono essere apportate a tali protocolli per valutare il ruolo di specifici recettori NK nello scatenare la lisi delle cellule NK di infezione da HIV delle cellule tramite l&#39;incubazione del effettori o obiettivi prima di co-coltura con anticorpi antagonista ai recettori specifici o ligandi 6,11. Citochine trattati con cellule NK (ad esempio, IL-2, IL-15) può essere utilizzato per valutare la funzionalità delle cellule NK stimolate 12. Allo stesso modo, anticorpo-dipendente saggi di citotossicità delle cellule potranno essere eseguiti usando questi protocolli. Anticorpi anti-HIV (es. anti-gp120) possono essere aggiunti alle cellule bersaglio per il riconoscimento da parte delle cellule NK bassa affinità per il recettore Fc CD16 13. Questi test, pur essendo stato creato per misurare le risposte delle cellule NK citotossiche per le cellule infettate da HIV, possono anche essere modificati per misurare la capacità delle cellule NK per la produzione di citochine dopo infezione da HIV riconoscimento delle cellule. Anche se abbiamo descritto in questo protocollo l&#39;uso di cellule in vitro le cellule infette come obiettivo abbiamo recentemente descritto la generazione di cellule bersaglio da pazienti infettati con HIV. Ciò richiede l&#39;isolamento di cellule CD4 + T-cellule seguita dalla dilatazione delle cellule nel corso di un periodo di due settimane dopo stimolazione con mitogeni in presenza di interleuchina-2 11. Dopo il periodo di due settimane di espansione, i protocolli descritti in questo articolo sono utilizzati per isolare le cellule bersaglio.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

Natural killer (NK) sono una componente vitale della risposta immunitaria innata di cellule infettate da virus. E &#39;importante capire la capacità delle cellule NK di riconoscere e lisare HIV-1 le cellule infettate a causa individuare eventuali aberrancy nella funzione delle cellule NK contro le cellule infettate da HIV potrebbe portare a terapie che potrebbero aumentare la loro attività citolitica. Vi è la necessità di utilizzare con infezione da HIV primario delle cellule T esplosioni come cellule bersaglio piuttosto che infetta-linee di cellule T nel test di citotossicità. Linee di cellule T, anche in assenza di infezione, sono molto sensibili alla lisi delle cellule NK. Inoltre, è necessario l&#39;utilizzo di cellule autologhe primarie per evitare grandi complessi di istocompatibilità di classe I squilibri tra il bersaglio e cellule effettrici che si tradurrà in lisi. I primi studi valutare le risposte delle cellule NK citolitica di primari di HIV-infettate le cellule non è riuscito a mostrare l&#39;uccisione significativa del 1,2 cellule infette. Tuttavia, con HIV-1 infetti primarie cellule T come cellule bersaglio nei test funzionali delle cellule NK è stata difficile a causa della presenza di contaminanti cellule non infette 3. Questa cellula infettata incoerente rapporto tra cellule non infette si tradurrà in una modifica uccidendo cellule NK tra i campioni che non può essere dovuto alla variabilità in funzione dei donatori di cellule NK. Pertanto, sarebbe utile per lavorare con una popolazione purificata cellule infette al fine di standardizzare le effettrici delle cellule di indirizzare i rapporti tra esperimenti 3,4. Qui mostriamo l&#39;isolamento di una popolazione altamente purificata di HIV-1 le cellule infettate sfruttando la capacità di HIV-1 di down-modulare CD4 su cellule infettate e la disponibilità di kit commerciali per rimuovere le cellule morte o morenti 3-6. L&#39;infezione primaria purificato di cellule T esplosioni possono poi essere utilizzati come bersagli sia in un degranulazione o test citotossico con purificato le cellule NK, come la popolazione effettore 5-7. L&#39;uso di cellule NK come effettori in un test di degranulazione valuta la capacità di una cellula NK per la diffusione del contenuto litica dei lisosomi specializzate 8 chiamata &quot;granuli citolitica&quot;. Con la colorazione con un anticorpo fluorocromo coniugato contro CD107a, una proteina di membrana lisosomiale che diventa espresso sulla superficie delle cellule NK, quando i granuli citolitica fusibile alla membrana plasmatica, siamo in grado di determinare la percentuale di cellule NK degranulano in risposta al riconoscimento delle cellule bersaglio. In alternativa, l&#39;attività delle cellule NK litica può essere valutata in un test citotossico che consente la determinazione della percentuale di cellule bersaglio lisate dal rilascio di 51 Cr all&#39;interno della cellula bersaglio in presenza di cellule NK.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Saggi di citotossicità per misurare le risposte delle cellule naturali litici killer per le cellule infettate da HIV è limitata dalla purezza delle cellule bersaglio. Dimostriamo qui l&#39;isolamento di una popolazione altamente purificata di infezione da HIV-1 primario a cellule T colpi sfruttando la capacità di HIV-1 s di down-modulare CD4.

Preparazione e utilizzo di HIV-1 CD4 infetti primaria + T-Cells come cellule bersaglio nei test di cellule Natural Killer citotossici

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

preparation-use-hiv-1-infected-primary-cd4-t-cells-as-target-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

25.7K Views.  Rush University Medical Center. Saggi di citotossicità per misurare le risposte delle cellule naturali litici killer per le cellule infettate da HIV è limitata dalla purezza delle cellule bersaglio. Dimostriamo qui l'isolamento di una popolazione altamente purificata di infezione da HIV-1 primario a cellule T colpi sfruttando la capacità di HIV-1 s di down-modulare CD4.