著者らは、シーケンシングの結果を提供することで彼らの助けのために博士Keji趙の研究室（NIH / NHLBI）に感謝したいと思います。また、読み込み、マップされたシーケンスを視覚化するためにゲノムブラウザを使用するためのUCSCゲノムプロジェクトに感謝​​します。 この作業は、起動時にXCに資金NICHD、ルシールParkard財団、ジョンズ·ホプキンス大学からの独立賞、R01HD065816にR00HD055052 NIH経路によってサポートされてい

（チップ全体の手順は約2日かかります。ハイスループットシーケンシング用チップライブラリーの調製別の2〜3日かかります。） 1。解剖するとChIP実験（〜1万個の細胞）の組織を準備する<ol><li>冷PBS + 1×プロテアーゼ阻害剤（7倍のストック溶液を得るために1.5 mlの1X PBS中のプロテアーゼインヒビターカクテル1ペレットを溶解）で（ ショウジョウバエ精巣の例えば、200ペア）を、目的の組織を解剖+ PMSF（最終濃度は100μg/ mL）を。回組織をすすぎ、阻害剤と同じPBS溶液200μLに組織を再懸濁します。 </li><li>サンプルを修正するには、5.5μLの37％ホルムアルデヒド（37使用する前に1分間℃の水浴中で暖かいホルムアルデヒド）を追加します。 15分、渦の間に5分ごとに37℃でインキュベートします。 </li><li> 2分間解決するために組織のサンプルを氷上に置きます。 450μLのPBS（プロテアーゼ阻害剤とPMSFを含む）で2倍すすいでください。サンプルは、現在店舗になります-20℃でのD ChIPのための十分な材料を得るために解剖を数回繰り返します。 </li></ol> 2。 ChIPアッセイのためにタンパク質-DNAコンジュゲート上清の準備<ol><li> 1.75 mLのエッペンドルフチュー​​ブにステップ1.3から十分なサンプルを兼ね備えています。 </li><li>組織サンプルからPBSを削除します。溶解緩衝液200μL（50mMのトリス-HCl、pHは7.6、1mMの塩化カルシウム、0.2％トリトンX-100またはNP-40、5 mMの酪酸、および1xプロテアーゼ阻害剤カクテル）を追加します。溶解バッファー（0.5mMのPMSFの最終濃度）に新鮮なPMSFストック溶液を追加します。組織が任意の凝集することなく完全に解離するまで10分間RT（室温）でインキュベートし、青ホモジナイザー（フィッシャー猫＃749521から1590）でホモジナイズする。 </li><li>超音波：パワー20で使用するマイクロチップの超音波（Misonix HS-XL200）。 50秒を氷上で10秒と残りのための超音波洗浄します。 （長い超音波処理は、小さな断片が得られるように最適な超音波処理時間は、経験的に決定されるべきである。ヒストンに対する抗体を用いたChIPのために4-5回を繰り返します。eの修正は、我々は通常、約200から300 bpまでのクロマチン超音波処理し、転写因子やクロマチンレギュレータ（例えば、ポリコーム蛋白質）のために、我々は通常、200から1000塩基対にクロマチン超音波洗浄します。しかし、最適なフラグメントサイズは​​経験的にテストする必要があります。注：必ず加熱からサンプルを防ぐために超音波処理中であっても、チューブを氷上にキープ！ </li><li> 1.8mlのRIPAバッファー（10mMトリス-HCl、pHが7.6で説明したのと同じ濃度のプロテアーゼ阻害剤とPMSFと1mMのEDTA、0.1％SDS、0.1％のNa-デオキシコール酸、1％トリトンX-100、追加することにより、試料を希釈する以前に）。架橋を逆にする（O / N）℃で一晩65℃2μL、5M NaClおよびインキュベーションを追加することにより、入力コントロールとして40μLを保存します。 </li><li>ビーズに抗体を結合するために、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに40μLのプロテインAビーズを追加し、その後、2分間、4℃で600μLのPBSと岩を追加磁石にビーズを適用し、上清を除去します。 100のPBSμLと目的の抗体を追加します（抗体の量は、empir決定されるべきであるically）。 4時間1時間または4℃室温でインキュベートします。 </li><li>磁石でビーズから上清を除去し、ステップ2.4​​からビーズに1mLのクロマチン抽出液を追加します。 4℃で回転させてCO / N. </li><li>磁石にチップのサンプルを適用し、上清を除去します。 10分ごとに4℃以下のバッファ°Cでビーズを洗浄します： RIPA緩衝液1 mLで2倍[1.89 mLの &#39;RIPAバッファー&#39; + 315μL7Xのプロテアーゼ阻害剤+ 20μLPMSF]; RIPA緩衝液1 mLで2倍+ 0.3 M NaClを[1.89 mLをRIPAバッファー+ 220μlの3 MのNaCl]; LiClを緩衝液1 mL（0.25 M LiClを、0.5％NP40、0.5％NaDOC）で2倍。 1X 1X TE 1mlの+ 0.2％トリトンX-100; 1X TEを1 mLの1X。 </li><li>架橋を逆にするには、100μlのTEバッファーでビーズを再懸濁し+ 3μL、10％SDS +プロテイナーゼK（20 mg / mL）を5μL。 65℃でインキュベートCO / N. </li><li>磁石にビーズを適用し、新しいチューブに上清を移す。上清は、あなたのDNAサンプルが含まれています。 100μLのTE + 0.5 Mでビーズを洗浄NaClおよび2上清を兼ね備えています。 </li><li>フェノール - クロロホルムDNAサンプルを抽出します。 Chlorofrom：IAA（25:24:1）を混合し、ボルテックスフェノール200μLを追加します。室温で5分間、14Kでスピン。また、DNAはキアゲンPCR精製キットを使用して抽出することができます。 </li><li>新しいチューブに上清/水層を移し、上清の各1mLのために20 mg / mLで20μg/ mLの（あるいはグリコーゲンの1μLの最終濃度にリニアアクリルアミドを追加しても使用することができます。グリコーゲンが使用されますリニアアクリルアミドはアッセイをシークエンシングのために使用されている間に、後続の定量PCRまたはPCR分析は。）3M NaOAcの20μLと500μLの100％EtOHを追加します。よく混ぜ、80℃でインキュベート℃で10分間。 4℃で20分間最大速度で回転℃、 </li><li>上清を除去し、300μLの70％エタノールで洗浄する。 50μLのTE緩衝液で空気乾燥して再懸濁したサンプル。サンプルは現在-20℃で保存することができますサンプルは、定量PCR（qPCR）アッセイ（ 図1）に使用することができます。 </li></ol> 3A。定量PCRを用いたChIP-EDのDNAを分析する<ol><li>原液、1/10、1/100、1/1000、1/5000：標準曲線を作成するには、以下の濃度でゲノムDNAを希釈する。 </li><li>各プライマーペアに対して、ステップ3a.1、入力制御とChIP-ED DNAからゲノムDNAを96ウェルプレートで重複して定量PCRを設定します。 10μLの2倍のSYBR PCRミックス（Fermentas、K0222） 1μL10μMフォワードプライマー; 1μL10μMリバースプライマー; XμLのChIP-ED DNA（インプットコントロール、またはゲノムDNA）; YμLのヌクレアーゼフリーH 2 Oは、20μLの反応液量を調整することができます。 </li><li>ミニプレートスピナー（Labnet）を96ウェルプレートをスピンダウンします。 </li><li>以下の条件を使用して、ABI 7300リアルタイムPCRシステム（または他のリアルタイムPCRシステム）で定量PCRを行います。 ステージ1：50℃2分、1サイクルのC; ステージ2：95℃で10分間、1サイクル; ステージ3：95℃15秒、60℃で1分間、40℃ycles。 ステージ4（解離段階）：95℃15秒、60°C、1分間、95℃15秒間CのC。 </li><li>解離曲線を確認してください。熱解離のプロット1つのピークは、PCR反応から単一のアンプリコンを示唆している。複数のピークは、プライマーペアと非特定の製品を示し、定量PCRのデータは、使用すべきではありません。 </li><li> 3aの希薄化後のゲノムDNAのシリーズを使用して標準曲線に基づいているCT（サイクル閾値）の値に従って、DNA量を解決する数式を計算することにより、各プライマーセットのPCR反応の指数関数的増幅の線形位相を決定します。 1。 </li><li> CHIP-ED DNAと入力コントロールのCt値は、CT値の直線範囲内にある場合は、2.4でのChIP-ED DNAと入力コントロールの希釈率に従って、CHIP-ED DNA対入力の濃縮を計算します。 </li></ol>図3b。ハイスループットシークエンシング用のCHIP-ED DNAを増幅する。 <ol><li> CHIP-ED DNAミックスのエンド修復（使用EPICENTRE DNA END-リペアキット）、氷の上で設定します。 ステップ2.12 1から34μlのゲノムDNA（0.1〜5μg）を 5μlの10倍エンド修理バッファ 5μlを2.5 mMのdNTPミックス 5μlの10mMのATP XμlのH 2 O 49μlに反応量を調整する 1μlのエンド修復酵素ミックス（T4 DNAポリメラーゼ+ T4ポリヌクレオチドキナーゼ） 室温で45分間インキュベートします。キアゲンのMinElute反応を用いて反応を浄化する クリーンアップキットです。 30μlの溶出バッファー（EB）で溶出します。 </li><li> 3 &#39;末端にオーバーハングを追加します。 ステップ3b.1から溶出したDNA産物30μlの 5μlの10×NEBバッファ＃2 10μlの1 mMのdATPを 2μlのdH 2 Oで 3μlの5 U /μlのKlenow断片（3 &#39;→5&#39;エキソ） 37℃で30分間インキュベート℃、 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 10μlのEBに溶出します。 </li><li> Solexaリンカーライゲーション： ステップ3b.2から溶出したDNA 10μlの 10μlのDDH 2 O 2.5＆μ、L倍のT4 DNAリガーゼ緩衝液 イルミナから1μlのアダプターオリゴミックス（在庫から1/10-diluted） 2.5μlのT4 DNAリガーゼ（400単位/μl）を 室温で1時間インキュベートする。 MinElute ReactionCleanupキットを使用して反応を浄化する。 20μlのEBに溶出します。サンプルは現在-20℃で保存することができます</li><li> E-ゲル装置を用いてステップ3b.3から溶出したDNAサンプルを実行します。ゲル中300から500 bpのバンドを分離し、キアゲンのゲル抽出キット（このステップは、アダプターオリゴライゲーションから〜125 bpのセルフライゲーションリンカーを排除する）を用いて精製する。 12μlのEBに溶出します。 </li><li>イルミナからペアエンド（PE）のプライマーを用いてライブラリーを増幅する。 ステップ3b.4から溶出したDNAの10.5μL マスターミックスの12.5μL（2X备考HF、Finnzymes） PE1のPCRプライマー11μlの PE2のPCRプライマー21μlの PCR条件： 98℃30秒 （98°C 10秒、65℃30秒、72℃30秒）、繰り返し20サイクル 5分間72℃。 </li><li>ステップ3b.5からのサンプルは、標準的な2％アガロースゲルを使用して、適切なサイズのDNA（300〜500 bp）を選択した後のChIP-seqを使用することができます。サンプルは現在-20℃で保存することができます汚染を防ぐために、単一のゲル上の各チップのサンプルを分離することをお勧めします。サンプルは、ハイスループットシーケンシングのために提出することができます。 </li></ol> 3C。 Solexaのパイプライン分析<ol><li> 25-bpのシークエンスは、読み取りイルミナGenome Analyzerの（GA）パイプラインから得られた。 </li><li>すべての読み取りが参照配列を持つ2つのミスマッチまでできるように、エランド（塩基データの効率的なローカルアライメント）ソフトウェアを使用して、 ショウジョウバエのゲノム（DM3）に整列させた。 </li><li>一意にマッピングされた読み取りが下流解析のために保持された。複数の同一の読み取りの場合、最大3つのコピーは、PCR増幅からバイアスの可能性を減らすために保持された。 </li><li> GAパイプラインの出力は、ブラウザの拡張可能なデータ（BED）ファイルに変換されました。 </li><li>生成するには可視化のためにUCSCブラウザにアップロードするためのかつらファイルは、我々は、ウィンドウサイズとして4塩基対のDNA断片のサイズは160 bpで、以前の出版物3に記載されているPythonのかばんを使用していました。 </li><li>静かで発現する遺伝子に、ショウジョウバエの遺伝子を分類するために、我々はRPKMと呼ばれるデジタル数（キロベースあたりの/は/百万円、マップされたリードあたりのエクソン領 ​​域をマージ読み込み）を使用しました。 RPKMを持つ遺伝子= 0をRPKM≥1を使用してサイレント·グループと遺伝子として分類された、低中程度および高い発現レベルの遺伝子として3つのサブグループに分類することができる表されるグループに分類し、各グループには同じ数について持っている遺伝子。 </li><li>ヒストン修飾レベルおよび遺伝子発現を比較するために、我々は以前の出版物3に記載されているPythonスクリプトを使用していました。 </li></ol> 4。代表的な結果 BAMを使用したChIP-qPCRに結果の例（大理石の袋）変異体<html>精巣は、 図1〜4に示されています。 BAM精巣では、増殖性精原細胞から精母細胞5、6の差別化への移行に障害があります。我々は、この組織の種類に富む未分化な生殖細胞のソースとしてBAM精巣を使用しています。このような雄特異的転写因子87（mst87F）、ドン·ファン（DJ）、ファジィタマネギ（fzo）などの精子の分化に必要な分化遺伝子は、BAM精巣で表現されていません。これらの遺伝子は非常に抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾7（ 図1A）に富むが、アクティブH3K4me3とヒストン修飾8（ 図1B）、我々は7 &#39;一価&quot;と呼ばれるクロマチンの署名を欠いているされています。 H3K27me3またはH3K4me3とのいずれかの濃縮は、恒常的に発現サイクリン（CycA）遺伝子4正規化によって決定されます。 BAM変異体の精巣（ 図2）図1に示すように、定量PCRの結果を検証しました。3テストされた分化遺伝子のmst87F、DJとfzoを有する抗体の同じセットを（すなわち、抑圧的なH3K27me3とアクティブH3K4me3）は使用したコンテンツ&quot;&gt; CHIP-seqの分析、それらのゲノム領域は非常にH3K27me3はなく、H3K4me3と（ 図2A-2C）で濃縮されています。これとは対照的に、恒常的に発現CycA遺伝子が重要なH3K4me3と、その転写開始部位（TSS）（ 図2D）の近くの小さなH3K27me3バインディングを持っています。 さらに、示差的に発現する遺伝子の4つのクラスの転写開始近くH3K27me3とH3K4me3とのChIPのプロファイルは、各ヒストン修飾の機能と一致している。 図3Aに示すように、転写開始のH3K27me3下流の濃縮は、逆に遺伝子発現レベルと相関している。サイレント遺伝子は、一方で最高H3K27me3を持っている高発現遺伝子はH3K27me3バインディングはありません。これらのデータは、遺伝子発現におけるH3K27me3の抑圧的な役割と一致しています。対照的に、転写開始の周りH3K4me3との濃縮は、遺伝子発現に及ぼすH3K4me3との積極的な役割と一致し、遺伝子発現レベル（ 図3B）と逆相関を示した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig1.jpg" /> どちらの抑圧的なH3K27me3ヒストン修飾（A）または（B）BAM細胞に富む未分化変異体精巣のアクティブH3K4me3とヒストン修飾に対する抗体を用いたChIP-ED DNAの図1。qPCR解析。 （）BAM精巣では、分化遺伝子（Mst87F、DJ、fzo）が H3K27me3抑圧的なヒストン修飾飾られています。 （B）分化遺伝子はH3K4me3とアクティブなマークが枯渇している。標的遺伝子のチップDNA（ChIPのDNA /入力）のレベル（Mst87F、DJやfzo）が最初レフに正規化されました<html>制御CycA遺伝子のチップDNAのエル。エラーバーは独立した生物学的複製するから標準偏差を示しています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3745/3745fig2.jpg" /> 図2。 （A）Mst87Fの全ゲノム領域にわたるH3K27me3とH3K4me3と濃縮のUCSCゲノムブラウザスナップショット（B）DJと（C）fzoは 、（D）CycA遺伝子（D）のクロマチンの状態を反映しているではH3K27me3に富む領域を丸で囲んだ卑しいです。重複遺伝子CG7264、精巣（RPKM = 1）BAMで表されるが、非常に野生型精巣（RPKM = 130）8（7からのChIP-seqのデータ）で表されます。図1のChIPの結果の定量的PCR解析で使用されるプローブは、各プロットの下部にラベルが付けられています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 tp_upload/3745/3745fig3.jpg &quot;/&gt; 図3。精巣 7 BAMでH3K27me3とH3K4me3とを用いたChIP-seqのプロファイル 。 4遺伝子群（7509遺伝子）は、RNA-seqの結果を8に基づいてそれらの遺伝子発現レベルに応じて分類された。遺伝子の代表的なクラスは、上流の3キロバイトからの転写開始部位の下流3キロバイト（転写開始）に配列を使用して、特定のヒストン修飾の濃縮のためにプロットされます。これは（）H3K27me3（K27）の濃縮のプロファイルを生成し、（B）H3K4me3と（K4）は、各グループでのChIP-seqの分析は。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3745/3745fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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	<li>Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+the+chromatin+landscape+in+Drosophila+melanogaster.">Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster.</a> Nature. 471, 480-485 (2011).</li><li>Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells.">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li><li>Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li><li>Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+changes+at+differentiation+gene+promoters+as+they+become+active+in+a+stem+cell+lineage.">Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage.</a> Development. 138, 2441-2450 (2011).</li><li>Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles+and+benign+gonial+cell+neoplasm+act+in+the+germline+to+restrict+proliferation+during+Drosophila+spermatogenesis.">bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 124, 4361-4371 (1997).</li><li>McKearin, D. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bag-of-marbles:+a+Drosophila+gene+required+to+initiate+both+male+and+female+gametogenesis.">bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis.</a> Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).</li><li>Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent+and+unpoised+status+of+most+genes+in+undifferentiated+cell-enriched+Drosophila+testis.">Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis.</a> Genome Biol. 11, 42-42 (2010).</li><li>Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+alternative+splicing+and+chromatin+structure+in+Drosophila+gonads+revealed+by+RNA-seq.">Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq.</a> Cell Res. 7, 763-783 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

このプロトコルで説明したChIP解析の汎用性は、生物学的に関連したシステムではクロマチンの状態を勉強する機会を提供する別の組織で使用することができます。培養されたシステムからの細胞を用いたChIP実験は、細胞の大量を容易に得ることができるので、実行するために便利です。しかし、培養細胞は、必ずしも多細胞環境内のセルを反映するものではありません。生きた動物から切?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>完全なミニプロテアーゼインヒビターカクテル</td><td>ロシュ社</td><td> 11836153001 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド（37％） </td><td>スペルコ</td><td> 47083-U </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td>シグマ</td><td> 78830 </td><td></td></tr><tr><td> Kontesペレット乳棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> PCR精製キット</td><td>キアゲン</td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td>線形ポリアクリルアミド</td><td>シグマ</td><td> 56575-1ML </td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>キアゲン</td><td> 158930 </td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーン/ ROX定量PCRマスターミックス</td><td> Fermentas </td><td> K0223 </td><td></td></tr><tr><td>ミニプレートスピナー</td><td> Labnet </td><td> Z723533 </td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRシステム</td><td>アプライドバイオシステム</td><td> 4351101 </td><td></td></tr><tr><td>少量の超音波プロセッサ</td><td> Misonix </td><td> HS-XL2000 </td><td>モデル廃止</td></tr><tr><td>ダイナ、タンパク質</td><td>インビトロジェン</td><td> 100-01D </td><td></td></tr><tr><td>磁石をDynamag </td><td>インビトロジェン</td><td> 123-21D </td><td></td></tr><tr><td>フェノール：Chlorofrom：IAA </td><td>インビトロジェン</td><td> 15593-049 </td><td></td></tr><tr><td> EPICENTRE DNA END-リペアキット</td><td> EPICENTREバイオテクノロジー</td><td> ER0720 </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Reaction個のクリーンアップキット</td><td>キアゲン</td><td> 28204 </td><td></td></tr><tr><td>クレノウフラグメント（3 &#39;→5&#39;エキソ） </td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td> M0212S </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td><td>プロメガ株式会社</td><td> M1794 </td><td></td></tr><tr><td>アダプターオリゴヌクレオチド</td><td>イルミナ</td><td> PE-400-1001 </td><td></td></tr><tr><td>ペアエンドプライマー1.0および2.0 </td><td>イルミナ</td><td> 1001783 1001 784 </td><td></td></tr><tr><td> E-ゲルElectorphoresisシステム</td><td>インビトロジェン</td><td> G6512ST </td><td></td></tr><tr><td> 2X备考HFマスターミックス</td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation (chip) using drosophila tissue

エピジェネティクスは、研究クロマチンの状態は、異なる発達段階で異なる種類の細胞で異なる遺伝子発現に寄与してどのように急速に発展してフィールドのままです。エピジェネティックな調節は、成人期の胚発生と恒常性の間に細胞分化を含む生物学的プロセスの広いスペクトルに貢献しています。エピジェネティクス研究における重要な戦略は、様々なヒストン修飾とクロマチン因子が遺伝子発現を調節する方法を検討することである。この問題に対処するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）は、目的の細胞のDNAを持つ特定の要因の関連のスナップショットを取得するために広く使用されています。 ChIPのテクニックは、一般的に再現性のあるデータを生成するために豊かさと均一性を得ることができる出発材料として、培養細胞を使用しています。しかし、いくつかの制約があります：まず、ペトリ皿に細胞を成長させる環境は、このように、in vivoでのものとは異なる場合があります生体内の細胞の内因性のクロマチンの状態を反映していない。第二に、細胞のすべてではないタイプは、ex vivoで培養することができます。人々は、ChIPアッセイのための十分な材料を得ることができ、そこから細胞株の限られた数があります。 ここでは、 ショウジョウバエの組織を用いたChIP実験を行うための方法について説明します。出発原料は、このように正確に内因性のクロマチンの状態を反映することができ、生きている動物から組織を解剖しています。組織の多くの異なったタイプのこのメソッドの適応性は、研究者がより多くの生物学的に多くの生体 1、2 のエピジェネティック制御についての関連問題に対処することができます。ハイスループットシーケンシング（CHIP-SEQ）でこのメソッドを組み合わせることにより、さらに研究者らはエピ風景を取得することができます。

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Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

最近のハイスループットシーケンシング技術が大幅にクロマチン免疫沈降（ChIP）実験の感度を増加させ、精製した細胞や組織解剖を使用して、そのアプリケーションを求めている。ここでは、チップ技術を使用する方法を描く<em&gt;ショウジョウバエ</emよく特徴付けられた生物学的システムにおける内因性のクロマチン状態に対処することができます&gt;組織。

を使用してクロマチン免疫沈降（ChIP）ショウジョウバエ組織

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

chromatin-immunoprecipitation-chip-using-drosophila-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

25.0K ビュー.  Johns Hopkins University. 最近のハイスループットシーケンシング技術が大幅にクロマチン免疫沈降（ChIP）実験の感度を増加させ、精製した細胞や組織解剖を使用して、そのアプリケーションを求めている。ここでは、チップ技術を使用する方法を描くショウジョウバエ?...

ビデオ: Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Patterning of Embryonic Stem Cells Using the Bio Flip Chip

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such as tumor growth, stem cell differentiation, and stem cell self-renewal. A number of methods currently exist to modulate cell signaling in vitro. One method of modulating the total amount of diffusible signaling is to vary the cell seeding density during culture. Due to the random nature of cell seeding, this results in considerable variation in the actual cell-cell spacing and amount of cell-cell contact, and cannot prescribe the local environment. A more specific approach for modulating cell signaling is to use molecular inhibitors or genetic approaches to knock down specific signaling proteins, but both of these methods are best suited to manipulating small numbers of molecules. Here, we demonstrate a new approach to modulating cell-cell signaling that modulates the local environment of a cluster of cells by placing different numbers of cells at desired locations on a substrate. This method provides a complementary way to control the local diffusible and juxtacrine signaling between cells. Our method makes use of the Bio Flip Chip (BFC), a microfabricated silicone chip containing hundreds-to-thousands of microwells, each sized to hold either a single cell or small numbers of cells. We load the chip with cells simply by pipetting them onto the array of wells and washing unloaded cells off the array. The chip is then flipped onto a substrate, whereby the cells fall out of the wells and onto the substrate, maintaining their patterning. After the cells have attached, the chip can be removed (or left on). This approach to cell patterning is unique in that it: 1) doesn't alter the chemistry of the substrate, thus allowing cells to proliferate and migrate; 2) allows patterning onto any substrate, including tissue-culture polystyrene, glass, matrigel, and even feeder cell layers; and 3) is compatible with traditional microcontact printing, allowing the creation of extracellular matrix islands with cells placed inside those islands. In this video, we demonstrate the patterning of mouse embryonic stem cells onto tissue-culture polystyrene using the BFC.

We demonstrate a simple method for placing cells at desired locations on a substrate. This method patterns cells by flipping a silicone chip containing microwells filled with cells onto the substrate. This method provides a new way to modulate diffusible and juxtacrine signaling between cells.

バイオフリップチップを用いた胚性幹細胞のパターニング

Cell-cell interactions consisting of diffusible signaling and cell-cell contact (juxtacrine signaling) are important in numerous biological processes such ...

生物学

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

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Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...