この研究は、米国エネルギー省（DE - FG02 - 09ER09 - 08とDE - PS02 - 09ER09 - 18）、UCLAのジョンソン総合がんセンター、及び産学連携による実践的研究プログラム（UCディスカバリーグラント、bio07によってサポートされていました-10665）。我々は、F - 18放射性同位体と多くの洞察力の議論を提供するためのUCLAメディカルサイクロトロン施設で博士Nagichettiar Satyamurthyとスタッフに感謝。我々は、博士に感謝する。マイケルコリンズ、グレッグルブラン、ジョセフランバート、およびそれらの技術的な助言と支援のためのCEMからケラーバーンハー​​ト。私たちは、ダークウィリアムズ、ダーリンウィリアムズ、博士に感謝します。ジョセフ香港ダンリン、及びCEMマイクロ波反応器を変更する部品を設計し、加工用とSPE精製モジュールのマイケルヴァンダム。

1。初期の準備<ol><li> V -バイアル（5mLの）RV1は（バーを撹拌しながら）マイクロ波合成を行うための主な反応容器として使用されます。これは7つの入口/出口ポートを持つPEEKアダプタに接続されて接続し、マイクロ波空洞の内部に配置（図2を参照）。 RV2が原油を回収するためにSPEカートリッジ（I）に接続されている[18 F] SFB。 RV3は、最終的な[18 F] SFBの溶液を回収するためSPEカートリッジ（II）に接続されています。それは、特に生体分子の下流に放射性標識のために、PBS緩衝液中で再構成する前に対応するソリューションを集中して温水浴（40℃）に置くことができます。 </li><li> 原油を収集するためのセットアップ[18 F] SFB：MeCN中/ H 2 Oを埋める[6 mLの、1:4（v：v）中]リザーバーのためのソリューション、5％水溶液AcOHを（8 mL）を、MeCN中（2 mL）に、それぞれBとC、。その後、5％水溶液AcOHを（10mL）を洗浄した後、エタノール（10 mL）でSPEカートリッジ（I）（ポリスチレン、メルクLiCholut EN）をアクティブにする。 </li><li> 精製を収集するためのセットアップ[18 F] SFB：準備タンクDとE、H 2 Oを10mlとそれぞれジエチルエーテル3mlでいっぱい。第二SPEカートリッジ（II）（ポリスチレン、メルクLiCholut EN）は、上記と同様の手順によって活性化される。 </li><li>プレコンディショニングのためのHPLCカラム[逆相セミ分取カラム：;：HPLC（3ml /分の流量MeCN中/ H 2 O、1:1（v / v）を0.2％TFAを含む溶出バッファー）を起動します（ルナ、5μmのC18（2）100Å、250 × 10mm）で、Phenomenex、トーランス、CA、アメリカ合衆国]。 </li></ol> 2。乾燥[すなわち、非キャリアの付加、（NCA）] [18 F]フッ化物の調製<ol><li> [18 F] [18 O] H 2 O（100μL）のフッ素溶液は、エッペンドルフでKryptofix 222（20mg）を、1M K 2 CO 3水溶液（26μL）とのMeCN（0.8 mL）の混合物に追加されましたチューブ。ソリューション全体は、入口ライン1を介してRV1に転送する前に、よく混合する。 [18 F]フッ化物溶液はまた、フッ化物- 18をトラップする陰イオン交換カートリッジ（ウォーターズから例えばQMA -光をSep - Pak）を通過してから、MeCN中のK 2 CO 3とKryptofixの混合物とから溶出することができます。 </li><li> [真空下] RV1で残留水を除去するマイクロ波の制御プログラムの下で乾燥シーケンス（20W、3分）を実行します。システムの温度が50であるのでクールダウンした後° C、追加のMeCN（1.0mL）を反応器に導入され、シーケンスは一度繰り返されます。 </li></ol> 3。エチル4の合成- [18 F]フルオロベンゾ<ol><li>エチル4を含むDMSO溶液（0.4 ml）に- （N、N、N -トリメチルアンモニウム）安息香酸トリフレート（1.5 mg）の入口ライン2を介してRV1に追加されました。 </li><li>攪拌しながらマイクロ波の制御プログラムの下でラベリングシーケンス（50W、1分間）を実行させ、容器の冷却と、すべてのバルブは、エチル4を得た閉じて- [18 F]フルオロベンゾ（[18 F] 2）。 </li></ol> 4。カリウム4の合成- [18 F]フルオロベンゾ<ol><li> KOtBuを含むDMSO溶液（0.5mL）を（13 mg）に入口ライン3を介してRV1に追加されました。 </li><li>攪拌し、容器の冷却と電子レンジの制御プログラムの下でプログラム（40 W、1分）を脱保護実行し、すべてのバルブが4を得た閉じて- [18 F]フルオロベンゾ塩（[18 F] 3）。 </li></ol> 5。原油の合成[18 F] SFB <ol><li> TSTU（30 mg）を含むアセトニトリル溶液（2.5mL）中に入口ライン6を介してRV1に追加されました。 TSTUは湿気や光に敏感です。それは小さなバイアルに分注し、4℃でアルミホイルでカバー密閉容器に保管する必要があります。 </li><li>攪拌し、容器の冷却と、すべてのバルブを持つマイクロ波制御プログラムの下でカップリングシーケンス（30W、2分を）実行すると、[18 F] SFB原油を買う余裕が閉鎖。 </li></ol> 6。 SPE精製[18 F] SFBの調製<ol><li> 5％水溶液AcOHを（1.0mL）を反応混合物を中和するために入口ライン7を介してRV1に追加されました。次いで、この溶液を5％水性AcOHを（図2）8mlを含むバイアルBに移した。 </li><li>原油[18 F] SFBを使用して、窒素（10 PSI）をトラップするためにSPEカートリッジ（I）を介して希釈した反応液を渡します。 </li><li>タンクAから：MeCN中とH 2 O [10 mLを、1:4（V V）]の混合物とWASH SPEカートリッジ（I） </li><li> [18 F] SFBはリザーバーC.からのMeCN（2 mL）を用いてRV2に出て溶出した</li></ol> 7。原油の精製[18 F] SFBとラジオ- HPLC <ol><li>どちらの原油を希釈する[18 F] SFBまたはSPE精製[18 F] RV2のH 2 O（2mL）でSFBとHPLCループ（5 mL）に混合物を移す。ソリューションは、ラジオHPLCに注入した[MeCN中/ H 2 O、0.2％TFAを含む1:1（v / v）を、流速：3mL /分]。 </li><li>精製した[18 F] SFB（リテンションティムを含む画分を収集E：8-10分）バイアルD（H 2 O 10mlであらかじめ設定）（図2）に。重要なステップは：正常に実行した場合は、ここで収集された分数のボリュームは、4〜5ミリリットルにする必要があります。 </li><li>精製された[18 F] SFBを使用して、窒素（10 PSI）をトラップするためにSPEカートリッジ（II）を介して希釈した反応液を渡します。 2〜3分間窒素流でカートリッジを乾燥させます。 </li><li> [18 F] SFBはリザーバーE.からジエチルエーテル（3 mL）を用いてRV3に出て溶出した。 </li><li>水浴（40℃）を用いて窒素ガスの緩やかな川の流れ（10 PSI）で乾燥するまでRV3で溶剤を蒸発させる。最後の乾燥[18 F] SFBはダウンストリームアプリケーションにPBSバッファーに再構成することができる。 </li></ol> 8。代表的な結果： 我々は、SFBは、各放射化学/化学的変換中に無水条件とマイクロ波加熱下で脱保護戦略を使用して、[18 F] を合成するための簡素化、迅速、ワンポット法を開発した。図1は、私たちのradiosynthesisの詳細を示します。最終製品の同一性は、非放射性SFBの基準とHPLCの保持時間の比較によって確認した。精製した[18 F] SFBは、その放射化学および化学的純度を決定するためにラジオTLCと- HPLCによって分析した。のRCY [18 F] SFBは、高放射化学的純度（&gt; 99％）と良好な化学的純度（HPLCプロファイルのUVトレースを参照して、図3に、HPLC精製（N&gt; 30）後60分以内に35 ± 5％であった）。比活性は約あった。開始放射能に応じて67〜330 GBq /マイクロモル（1.8〜9.0 CI /マイクロモル）、。 <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のマイクロ波アシストワンポットradiosynthesis [18 F] SFB。最初に、エチル4のradiofluorination - （N、N、N -トリメチルアンモニウム）安息香酸トリフレート（1）の存在下でマイクロ波加熱（50 W、1分）で行った[K⊃2.2.2] [18 F] F -エチル4を得たジメチルスルホキシド（DMSO）の複雑な- [18 F]フルオロベンゾ（[18 F] 2）。精製することなく、カリウムtert -ブトキシド（T BuOK）のDMSO溶液を加え、反応容器は、無水脱保護を完了するには照射マイクロ波（40 W、1分）であった。の最終的な変換[18 F]に3 [18 F] SFBがO -（N -スクシンイミジル）を使用して達成された- N、N、N&#39;、N&#39; -テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU）活性化を。アセトニトリルのTSTU、4を含む反応混合物に添加された- [18 F]フルオロベンゾ（[18 F] 3）塩を、この最後の合成工程では、得られた粗製の[18 F]加熱後のSFB（30 W、2分）。 <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。[18 F] SFBの合成ワンポットマイクロ波アシストのためのセットアップの概略図。 <img src="/files/ftp_upload/2755/2755fig3.jpg" alt="図3" /> 図3、最終のラジオ- HPLクロマトグラム[18 F] SFB。トップ：254nmのUV信号、下：放射性シグナル、挿入図：254nmの（X 33.3）でのUV信号。 <img src="/files/ftp_upload/2755/2755table1.jpg" alt="表1" /> 。表1の概要アルキル4を使用して、文献に報告されている[18 F] SFBのradiosyntheses - （トリメチルアンモニウム）の前駆体としての安息香酸トリフ。

このメソッドは、米国の特許出願のために送信されました。

この簡略化した三段階、ワンポット18 F -アシル化試薬のradiosynthesis [18 F] SFBを非水性化学に基づいて開発された。このプロセスは、優れた再現性を有しており、の生産のために確実に使用することができる等により以下のように説明する2つのキーの変更に自動化された放射化学のモジュールの[18 F] SFB、：1。我々は、一般的な水性塩基性または酸性のソリューションを...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>水溶液中の酢酸（5％、v / v）の</td><td>フィッシャー </td><td> A38 - 500 </td><td>私たちの研究室で作製</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 75-05-8 </td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 14775 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 472301 </td><td></td></tr><tr><td>エチル4 - （N、N、N -トリメチルアンモニウム）安息香酸トリフ</td><td>ラボで作製</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4,7,13,16,21,24 - Hexaoxa -1,10 - ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサン（K222） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 29,111-0 </td><td></td></tr><tr><td> O - （N -スクシンイミジル） - N、N、N&#39;、N&#39; -テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 105832-38-0 </td><td></td></tr><tr><td>水溶液中で炭酸カリウム（1M） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 209619 </td><td>私たちの研究室で作製</td></tr><tr><td>カリウムtert -ブトキシド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 156671 </td><td></td></tr></tbody></table>

microwave-assisted one-pot synthesis of n-succinimidyl-4-[18f]fluorobenzoate ([18f]sfb)

ペプチド、1-9タンパク質、10,11と抗体とその工学的断片を含む生体分子、、12-14潜在的な治療薬と分子イメージング剤の両方として重要性を増している。特に、陽電子放出放射性同位体（例えば、Cu - 64、GA - 68、またはF - 18）で標識したとき、彼らは多くの生理学的および病理学的プロセスの標的イメージング用のプローブとして使用することができます。15から18このため、多大な努力がいる18 F標識生体分子の合成と探索に専念。ペプチドの直接の18 F標識の優雅な例があるが、直接radiofluorinationに関連付けられている19から22まで過酷な反応条件（すなわち、有機溶剤、極端なpH、高温では）通常、壊れやすいタンパク質試料との互換性がありません。日付に、そのため、生体分子に放射性標識補欠分子族の取り込みは、選択の方法のまま。23,24 N -スクシンイミジル-4 - [18 F]フルオロベンゾ（[18 F] SFB）、25から37の生体分子の一級アミノ基と反応するボルトン-ハンターのタイプの試薬​​、18 F -標識のために非常に多目的な補欠分子族である生体内安定性と高い放射性標識の収率で 、その明らかなの面で生物学的実体の広いスペクトル、の。で標識後SFB、結果として得られる[18 F] fluorobenzoylated生体分子は 、in vivoイメージングの研究での潜在的なPETトレーサーとして検討することができる[18 F]。現在の文献で ​​説明されている1ほとんどの[18 F] SFBのradiosyntheses二つあるいは3原子炉を必要とし、固相抽出（SPE）または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のいずれかを使用して複数の精製。そのような長いプロセスは、そのルーチンの生産と生体分子の放射性標識の広範なアプリケーションを妨げる。いくつかのモジュールアシスト[18 F] SFBの合成が報告されているが、29から32まで、41から42彼らは主に高価な市販の放射化学ボックス（ 表1）を使用して複雑で煩雑な手続きに基づいています。したがって、のradiosynthesisのさらなる簡素化[18 F] SFB低コストのセットアップが自動化されたプロセスへの適応のための非常に有益である使用。 ここで、我々はの簡潔な準備報告[18 F]簡略化されたワンポットマイクロ波支援合成（ 図1）に基づいて、SFB、。我々のアプローチは、手順または任意の水性試薬との間の浄化を必要としません。さらに、いくつかのPETトレーサーの合成に使用されているマイクロ波照射、、38から41はより高いRCYsと対応する熱反応よりも優れた選択性を与えることも、短い反応時間で同じような利回りを提供する。38最も重要なことは、生体分子を標識化するとき、保存された時間が、その後のバイオコンジュゲーションまたはPETイメージングのステップに転用される可能性が28,43私たちの改善された[18 F]の新規性SFBの合成は2倍になる：（1）無水脱保護戦略は、間の中間のない精製（s）を必要としない各ステップは、（2）マイクロ波アシスト放射化学的変換は、[18 F] SFBの迅速な、信頼性の高い生産を可能にします。

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Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

の容易な、ワンポット合成N -スクシンイミジル-4 - [<sup&gt; 18</sup&gt; F]フルオロベンゾ（[<sup&gt; 18</sup&gt; F] SFB）は、非水性、三段階放射化学的プロセスに基づいて開発されました。マイクロ波加熱を使用して、全体の手順は30分以内、または分取HPLCによりさらに精製すると60分で完了することができます。崩壊補正放射化学的収率（RCYsは）35から5パーセント（N&gt; 30）であった。

のマイクロ波アシストワンポット合成 N -スクシンイミジル-4 - [ 18 F]フルオロベンゾ（[ 18 F] SFB）

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

microwave-assisted-one-pot-synthesis-n-succinimidyl-4

Research

JoVE Journal

Biology

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

12.9K ビュー.  University of California at Los Angeles. の容易な、ワンポット合成N -スクシンイミジル-4 - [ 18 F]フルオロベンゾ（[ 18 F] SFB）は、非水性、三段階放射化学的プロセスに基づいて開発されました。マイクロ波加熱を使用して、全体の手順は30分以内、または分取HPLCによりさらに精製すると60分で完了することができます。崩壊補正放射化学的収率（RCYsは）35から5パーセン?...

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described. Triplicate runs of 48 parallel experiments are reported, varying concentration, solvent and the excess of some of the reagents. The isolation of the product was achieved by a simple filtration and wash procedure. The highest yield obtained was 66% from 0.4 M methanol with 1.2 eq. of imine. This is significantly above the 49% yield obtained from the initial reaction under equimolar concentration at 0.4 M in methanol. Methanol solutions with reagent concentrations of 0.4M or 0.2M gave superior yields while all solvent systems at 0.07M performed poorly. At 0.2M, methanol and ethanol/methanol (60/40) mixtures were statistically equally good while THF/methanol (60/40) was poor and acetonitrile/methanol (60/40) was intermediate. Good reproducibility of the precipitate yields was obtained in these replicate experiments, allowing for subtle interaction effects to be positively identified.

The Ugi reaction has proved to be a convenient way to quickly create diverse libraries of compounds. It involves the reaction of an amine, an aldehyde, a carboxylic acid and an isonitrile typically in methanol at room temperature. In this video, we utilize a 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock equipped with filtration tubes and a Mettler-Toledo MiniMapper automated liquid handler was used to deliver the reagents and solvent. The parameters of interest were the concentration, the solvent composition and the excess of some of the reagents.

パラレル合成と自動液体ハンドリングを使用してUgi反応の最適化

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

生物学

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

生体系における酸素イメージング用燐光ナノプローブの合成とキャリブレーション

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

の合成<emインビボ&gt;</em&gt; MRIで検出可能なアポトーシスプローブ

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

官能ビス - ペプチドの固相合成方法を &quot;安全キャッチ&quot;を使用して

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields of regenerative medicine, basic cell biology, treatment of diseases, and reprogramming of cells. Here, we describe a step by step protocol for generation of modified mRNA with reduced immune activation potential and increased stability, quality control of produced mRNA, transfection of cells with mRNA and verification of the induced protein expression by flow cytometry. Up to 3 days after a single transfection with eGFP mRNA, the transfected HEK293 cells produce eGFP. In this video article, the synthesis of eGFP mRNA is described as an example. However, the procedure can be applied for production of other desired mRNA. Using the synthetic modified mRNA, cells can be induced to transiently express the desired proteins, which they normally would not express.

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In this video article, we describe the in vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in cells.

ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and degradation instigates a multitude of age-related diseases. Decline of proteostasis quality control mechanisms is a hallmark of ageing. Biochemical methods to detect de novo protein synthesis are still limited, have several disadvantages and cannot be performed in live cells or animals. Caenorhabditis elegans, being transparent and easily genetically modified, is an excellent model to monitor protein synthesis rates by using imaging techniques. Here, we introduce and describe a method to measure de novo protein synthesis in vivo utilizing fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Transgenic animals expressing fluorescent proteins in specific cells or tissues are irradiated by a powerful light source resulting in fluorescence photobleaching. In turn, assessment of fluorescence recovery signifies new protein synthesis in cells and/or tissues of interest. Hence, the combination of transgenic nematodes, genetic and/or pharmacological interventions together with live imaging of protein synthesis rates can shed light on mechanisms mediating age-dependent proteostasis collapse.

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe a nonradioactive and noninvasive method to assess de novo protein synthesis in vivo, utilizing the nematode Caenorhabditis elegans and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). This method can be combined with genetic and/or pharmacological screens to identify novel modulators of protein synthesis.

カエノハブディティス・エレガンスにおけるデノボタンパク質合成率の評価

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...