レーザーキャプチャマイクロダイセクションとCEL-Seq2と呼ばれる単一細胞RNAシークプロトコルを組み合わせて、小さな個々の組織サンプルのトランスクリプトームデータセットを生成します。この技術により、従来の細胞選別法では研究できない組織や種における遺伝子発現を研究することができます。さらに、バルクRNA-seqアプローチよりも特異性を提供します。
ここでは、C.elegansの第4幼虫期の雄および雌雄同体のうちの4つの細胞尾先端についてこの技術を実証した。しかし、このアプローチの美しさは、それが非モデル種にも適用できることです。この手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるRaya Jallad氏と、現在テネシー州チャタヌーガのBaylor学校で生物医学科学者を率いるAntonio Herrera博士です。
まず、1 ~ 2 ミリリットルの M9 バッファーをプレートの壁にそっとピペッティングし、噴出させません。プレートを渦巻いてワームを取り除きます。穴を突かないように、ピペットチップを寒天の端にあるプレートの壁に押し付けて、すべての液体とワームを取り除いて捨てます。
このビデオは、母親と幼虫が取り除かれる前のプレートを示しています。母親と幼虫が取り除かれた後、胚だけが残されるべきです。L1幼虫は、1時間ほど孵化した後に現れ始めます。
次に、プレートを摂氏25度に置きます。1時間後、プレートをインキュベーターから取り出します。寒天上に1ミリリットルのM9バッファーを慎重に落とし、プレートを渦巻いてL1を排出しますが、胚は取り除きません。
チューブを遠心分離し、L1sを播種したプレートの細菌芝生に直接ピペットで送ります。ワームは摂氏25度に保ちます。30〜50倍の倍率の解剖顕微鏡下で、同期プレートから別々の非装着プレートにオスと雌雄同体をピッキングし始める。
男性は、雌雄同体の尾の尖った形と暗い色と比較して、雄の尾の膨らんだ形と明るい色によって雌雄同体と区別されます。0.01%洗剤を含むM9バッファーで予備洗浄したピペットチップを使用して、1〜2ミリリットルのM9バッファーでプレートからワームを洗い流します。ワームを1ミリリットルの遠沈管に移し、1分間回転させ、1ミリリットルのM9バッファーを加える。
もう一度、1分間回転します。氷冷70%メタノールを1ミリリットル加え、よく混ぜる。1ミリリットルのメタノールで洗浄を繰り返し、よく混ぜる。
それを1分間回転させ、500マイクロリットルの70%メタノールを加える。それを混ぜて、摂氏4度で1時間から一晩保存します。固定されたワームのピペット20マイクロリットルをポリエチレンナフタレートまたはPEN膜スライドガラスのコーティング側に。
メタノールが蒸発するのを待ちます。ステージ上のプラスチックシールドを取り外し、上向き矢印の付いたアンロードボタンをクリックして、メンブレンスライドをロードします。スライドが完全に乾いていることを確認し、メンブレンが下を向くように反転してスライドを挿入します。
「標本の変更」ウィンドウで「続行」をクリックします。スライドホルダーが動きます。次に、画面の下部にあるプラスチックシールドを交換し、スライドが入っているスライドホルダーを選択し、下向き矢印の付いたアンロードボタンをクリックしてチューブをロードします。
トレイを引き出し、チューブブロックを取り外します。4 本の 500 マイクロリットル PCR チューブのチューブキャップをホルダーに挿入し、チューブを下に折り畳みます。ブロックをトレイに戻し、トレイを顕微鏡ステージに戻します。
変更コレクターデバイスのポップアップウィンドウで、PCR チューブを選択し、「OK」をクリックします。コレクタデバイスのチューブキャップの下にある画面の左下にある空のチューブ位置をクリックし、顕微鏡コントロールパネルで透過光明視野照明用のTLBFを選択します。2.5Xレンズを使用して、ワームとPEN膜の表面構造が見えるまでフォーカスを調整します。
20Xレンズに切り替えて、ステージをワームのない領域に移動します。膜内の気泡のような構造が黄色がかった色になるように焦点を調整して、レーザーを正しい焦点面に焦点を合わせ、レーザーパラメータを設定します。テールチップについては、速度20のパワー45アパーチャ30から始めます。
レーザーコントロールパネルで、キャリブレーションを選択し、指示に従います。次に、コレクターデバイスのチューブキャップで画面の下部で位置Aをクリックし、画面の右側で単一の形状を選択し、次に描画してカットします。次に、ポイントツーポイントを選択し、線を描きます。
レーザーが膜を切断するように「切断開始」をクリックします。ワームを見つけて、移動と切断に切り替えます。尾を切り取るためにマウスを使用してください。
解剖顕微鏡で膜切片を見つけ、下流のサンプル処理を続行します。ここでRNAシーケンシングはCEL-Seq2を用いた。1.2マイクロリットルのCEL-Seq2プライマーマスターミックスをピペットでサンプルの上に直接置き、チューブを閉じます。
プライマー番号でラベルを付け、直ちにチューブキャップをドライアイスの上に直接置き、サンプルをフラッシュフリーズさせて RNA の分解を防ぎます。すべてのサンプルが収集されるまで繰り返します。最後に、チューブをマイナス70°Cで保管します。
孵化後21〜23時間のC.elegans L3雌雄同体および雄は、それらの尾の形態によって解剖顕微鏡下で区別することができる。雌雄同体の物語は狭く、男性の物語は腫れてはっきりと見えます。PEN膜スライド構造とワームテールの外観は、これらの画像に示されています。
ここでは、顕微鏡の20Xレンズと40Xレンズの焦点が正しいです。PEN膜を公平に切り取った解剖された尾がここに見えます。カットの隙間を閉じた後、膜ピースはスライドの下のチューブキャップに落ちます。
解剖された尾先を含むPEN膜セクションを備えたチューブキャップがここに示されています。グラフィカル画像は、異なる時点および性別について、個々の尾先端あたりの自然対数変換された一意の分子識別子またはUMIカウントを表す。powsimRソフトウェアは、さまざまな発現レベルで差次発現またはDE遺伝子を検出するために必要な独立したサンプルの数を決定するために使用されます。
ここでのグラフィカル画像は、条件ごとに異なるサンプルサイズを組み込んだ4つの異なるシミュレーションについて、2つの条件間でDE遺伝子を検出するための真陽性率を表しています。破線は 80% の真陽性率を示します。ここでは、誤検出率と同じ 4 つのシミュレーションを示します。
破線は、10% の誤検出率を示します。グラフは、1条件あたり70テールチップのサンプルサイズが、非常に低い発現レベルの遺伝子を除いて、DE遺伝子を検出するのに十分であることを示した。適切な同期のために、胚のみがプレート上に存在することを確認してください。
サンプルの損失を防ぐために、プライマーミックスをキャップのPEN膜セクションに直接ピペットで送り、キャップを閉じる際に非常に穏やかにしてください。種にとらわれないため、このプロトコルを使用して、異なる種の相同構造のために遺伝子調節ネットワークがどのように進化したかを調べることができます。
