私たちは、教室や研究用途に最適なC.elegansゲノムDNAを抽出する簡単で迅速で費用対効果の高い方法を開発しました。これらのプロトコルは、PCRベースのアプリケーション向けに、C.eleganceの単一または少量のサンプルからDNAテンプレートを迅速に製造するために確実に使用できます。ワームを拾ったり、マイクロピペッターを使用した経験がないユーザーは、これらのスキルを必要とする手順に苦労する可能性があります。
熟練した開業医を見て練習することは助けになるかもしれません。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院4年生であるFarhan Lakdawalaです。単一のCaenorhabditis elegansワームからDNAを抽出するために、まず、サーモサイクラーで10分間摂氏55度で1サイクル、続いて95°Cで3分間からなる溶解プログラムを設定します。
溶解溶液を調製するには、まず、キットから0.8マイクロリットルの抽出溶液を氷上の0.2ミリリットルPCRチューブの内壁に加える。次いで、キットから0.2マイクロリットルの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加え、ペッティングにより混合する。DNA抽出のためのワームの選択により、まず、解剖顕微鏡下でL4または成体動物を同定する。
L4雌雄同体は、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部によって識別することができます。成体の雌雄同体を特定するには、プレート上で最大の動物の1つを選択し、その子宮内に楕円形の胚が見える可能性があります。次に、白金線ピックを用いて、選択した動物を溶液に移す。
チューブの底にある内容物を回収するには、チューブを室温で2000 x gで2〜3秒間遠心分離します。次に、チューブをサーモサイクラーに入れ、先ほど設定した溶解プログラムを実行します。この溶解プログラムが終わったら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。
次いで、キットから0.8マイクロリットルの中和溶液を加え、ピペッティングにより混合する。再度、チューブを室温で2000 x gで2〜3秒間遠心分離する。溶解液がすぐに使用されない場合は、将来の使用のためにチューブを摂氏4度に保管してください。
個々のワームからDNAを抽出するためにも、まず、1サイクルの溶解プログラムを摂氏55度で10分間、続いて95摂氏で3分間、サーモサイクラーで設定する。次に、まずキットから2マイクロリットルの抽出溶液を氷上の0.2ミリリットルPCRチューブの内壁に加え、続いてキットから0.5マイクロリットルの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に添加し、次いでピペッティングにより内容物を混合することによって溶解溶液を調製する。L4または成体動物を特定した後、プラチナワイヤーピックを使用して、適切な数の動物を溶液に移します。
次に、チューブを室温で2000 x gで2〜3秒間遠心分離し、チューブをサーモサイクラーに入れ、以前に設定した溶解プログラムを実行します。プログラム終了後、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。次いで、キットから2マイクロリットルの中和溶液をチューブに加え、ピペッティングにより混合した。
再度、チューブを室温で2000 x gで2〜3秒間遠心分離する。すぐに使用しない場合は、将来の使用のために溶解液を摂氏4度で保管してください。プロトコールによって抽出されたゲノムDNAはPCRテンプレートとして首尾よく使用することができ、市販のキットと従来のプロテイナーゼK法の両方が、2100塩基対産物と500塩基対産物のPCR増幅の同様のレベルでDNAを産生した。
DNA溶解のためのキット法はまた、様々なDNAポリメラーゼ酵素に有効なPCRテンプレートも提供した。異なる希釈であっても、市販のキットによって単一の動物から抽出されたDNAは、同等の効率で2100塩基対DNA断片のPCR増幅を支持した。しかしながら、500塩基対DNA断片の増幅は鋳型濃度によって変化した。
遺伝子型を決定するためのPCRテンプレートとして、単一の動物または複数の動物から抽出されたDNAの適合性は、遺伝子およびその変異変異体の増幅の成功によってさらに実証された。このプロトコルでは少量の試薬をピペッティングする必要があるため、一貫性を確保するために、複数の反応、優れた配管技術、および十分に較正されたピペットにマスターミックスを使用します。また、チューブの内容物をスピンダウンすると、適切な溶解が保証されます。
この方法はスケールアップされ、他の下流用途のためにC.elegansゲノムDNAを抽出するように適合し、他の線虫種からDNAを抽出するために使用することができる。プロトコルのシンプルさ、スピード、堅牢性、低コストを考えると、時間とリソースが限られている研究アプリケーションと教室アプリケーションの両方に適しています。
