Vogliamo riconoscere Tyson Foods Inc. per offrire generosamente le uova fecondate. Shanna Arnold è stato fondamentale durante le riprese di questo protocollo. Trenis Palmer è stato sostenuto dal National Institutes of Health sotto il Premio L. Ruth Kirschstein Servizio Nazionale delle Ricerche (F31 National Cancer Institute). Questo lavoro è stato parzialmente supportato da CCSRI di Grant # 700537 di JDL e NIH / NCI concedere # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 ad AZ.

1. Preparare le uova di xenotrapianto (metastasi spontanea) <ol><li> Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 10 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora. </li><li> Il giorno 10 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d&#39;oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d&#39;uovo alla fine ottuso dell&#39;uovo dove si trova il airsac. </li><li> La vena corioallantoidea si trova e segnato. Questa vena è situato nella parte superiore del guscio in cui è la giunzione di diverse grandi vasi sanguigni. A questo punto il ramo vaso sanguigno scende giù, lontano dalla CAM e attribuisce all&#39;embrione. Una finestra di 1 centimetro quadrato è disegnato con la matita sul guscio circa 1 cm di distanza dal punto di diramazione della vena. L&#39;area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Utilizzando uno strumento di taglio ruotante (Dremel) dotato di una pietra al carburo di silicio rettifica (parte Dremel # 84922), un buco si è esercitato attraverso l&#39;estremità smussata dell&#39;uovo nel sacco aria. Con questo strumento lo stesso un buco viene praticato all&#39;interno della piazza precedentemente disegnato sopra l&#39;uovo, fermandosi della membrana guscio d&#39;uovo. Un 25-gauge siringa con una fresa multa alla fine è usato per fare un piccolo foro nella membrana guscio facendo attenzione a non strappare il sottostante CAM. Il CAM è successivamente staccato dalla membrana guscio d&#39;uovo nella zona della piazza con aspirazione delicata creato con un aiuto pipetta automatica dotata di un pezzo di ¼ &quot;tubo Tygon posto dopo il buco nel airsac. Al momento l&#39;applicazione di aspirazione, una sacca d&#39;aria devono sotto il buco nella piazza che significa che la CAM è stata con successo caduto dal guscio d&#39;uovo. Dopo la CAM è caduto, il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in attesa del trapianto delle cellule tumorali. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale. </li></ol> 2. Preparare le uova per iniezione endovenosa (metastasi sperimentale) <ol><li> Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 12 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora. </li><li> Il giorno 12 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d&#39;oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d&#39;uovo alla fine ottuso dell&#39;uovo dove si trova il airsac. </li><li> La vena corioallantoidea si trova e segnato. Un rettangolo di 1 centimetro di 0,5 cm è disegnato con matita sul guscio direttamente sopra la vena. L&#39;area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Una piccola finestra viene creata nel guscio d&#39;uovo nel percorso disegnato con la punta Dremmel (# 118). La finestra viene rimossa per esporre la membrana sottostante guscio d&#39;uovo che viene successivamente reso trasparente con una goccia di olio minerale. Vedi 5A figura per una rappresentazione grafica. </li><li> A questo punto il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in previsione di iniettare le cellule tumorali. </li></ol> 3. Preparazione cellule tumorali per l&#39;innesto o iniezione. <ol><li> Per xenotrapianto, le cellule tumorali si staccano dalla loro piatti dalla cultura utilizzando tripsina / EDTA e lavate con 10 volumi di tampone fosfato (PBS) al fine di rimuovere tutti i supporti residuo, tripsina, o EDTA. </li><li> Per iniezione endovenosa, cellule in coltura sono staccati utilizzando cellule dissociazione non enzimatica soluzione, e lavato con DMEM senza siero. e) </li><li> Le cellule sono contati con un emocitometro e risospese in PBS a 1-40 cellule / ml per l&#39;innesto, o in alternativa risospese in DMEM senza siero a 1 milione di cellule / ml per iniezione ev. </li></ol> 4. L&#39;innesto delle cellule tumorali sul esposte di recente CAM (metastasi spontanee) <ol><li> Le uova vengono rimossi dal termostato e una piccola finestra è tagliata nella posizione della piazza precedentemente disegnato dove la bolla d&#39;aria nuova si è formata. Ciò è più facilmente realizzabile con un utensile rotante dotato di una rotella di taglio (utensili Dremel con il # 409 ruota di taglio circolare). Un paio di pinze ad ago naso viene utilizzato per rimuovere la piccola sezione di guscio d&#39;uovo e di esporre il CAM sottostante. </li><li> Utilizzando un cotone con punta applicatore (Brand Fisher # 23-400-001) la CAM è abrasa 5 volte. Un po &#39;di sangue dovrebbe essere evidente sul cotone. Immediatamente dopo danneggiare il CAM, 25μl di sospensione cellulare viene posizionato sulla zona danneggiata. Il numero ottimale di cellule è determinato empirically ma può variare da 5 a 0.5x10 1X10 6. La finestra nel uovo è ben sigillati con nastro adesivo ed i pulcini sono rimasti in piedi per 10-15 minuti in modo da consentire alle cellule di regolare. Dopo 15 minuti le uova vengono restituiti al fermo incubatrice. </li><li> I tumori sono permesso di crescere per 5-8 giorni a seconda della specifica applicazione e la natura della linea di cellule tumorali utilizzati. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale. </li></ol> 5. Iniezione endovenosa di cellule tumorali (metastasi Sperimentale) <ol><li> Utilizzando un contatore 30 100μl siringa di insulina di sospensione cellulare viene iniettata nella vena allantoide di ogni embrione, le uova sono stati restituiti ad un incubatore stazionaria e vi rimase per altri 1-7 giorni. </li><li> In momenti distinti, il polmone o inferiore CAM vengono raccolte da ogni embrione e trattati per l&#39;individuazione delle cellule tumorali, come descritto di seguito. </li></ol> 6. Tumori raccolta e tessuti pulcino <ol><li> Una zona dissezione è preparato. Il test rileva cellule metastatiche da quantificare il DNA umano con un approccio altamente sensibile della PCR. E &#39;quindi molto importante per evitare la contaminazione con il DNA esogeno. Dissezioni vengono eseguiti in un&#39;area dedicata e in tutto il dissezioni gli strumenti sono puliti tra ogni animale. Al fine di prevenire la contaminazione incrociata dei campioni di tutto il processo di dissezione 3 insiemi separati di strumenti sono utilizzati: un set per tagliare l&#39;uovo, uno per la rimozione del tumore primario e uno per la rimozione degli organi interni. Inoltre, quattro contenitori sono usati per lavare sequenziale risciacquo di strumenti tra ogni animale. In sequenza queste soluzioni di lavaggio sono: 1) Acqua bidistillata, 2) acqua bidistillata, 3) candeggina e 4) 70% di etanolo. </li><li> Le uova vengono rimossi dal fermo incubatore e messo in ghiaccio per 15 minuti per anestetizzare gli animali e eutanasia. Le finestre sono aperte in modo che i tumori diventano visibili. Aprire le finestre più grandi, rimuovendo alcune delle guscio può essere necessario. I tumori primari sono resecati dal CAM, pesato, e trattati per istologia. </li><li> Il pulcino è rimosso dal guscio d&#39;uovo tagliando il guscio radialmente in due metà uguali. L&#39;embrione viene decantato dalla shell taglio e trasferito in una parte pulita del seno barca soppesare. L&#39;animale è sezionato con l&#39;utilizzo di un nuovo, pulito serie di strumenti. L&#39;animale è aperta con il taglio dello sterno. Una volta che l&#39;embrione è aperta, un pezzo del fegato sia dal lobo destro o sinistro viene raccolto. Gli organi interni sono successivamente rimosso tirando delicatamente l&#39;esofago collegato al ventriglio e il taglio del visera che collegano gli organi. Al fine di raccogliere i polmoni tagliare la cassa toracica è aperta la piastra del seno è separata e il cuore è stato rimosso. A questo punto è possibile tagliare intorno ai quattro lati del polmone (la parte superiore più vicina alla testa sul lato sinistro lungo la gabbia toracica, la parte inferiore vicino al diaframma e il lato destro lungo la trachea). Per motivi di coerenza, il polmone stesso è raccolto in ogni animale. Campioni di tessuto raccolte sono conservati a -20 ° C per un uso successivo o possono essere trattati immediatamente per l&#39;isolamento di DNA. </li></ol> 7. Isolamento del DNA genomico e analisi PCR quantitativa <ol><li> Il DNA genomico viene estratto dai tessuti utilizzando il SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalogo # XNATRG). Il DNA estratto può essere trasferito in una provetta pulita eppendorf e conservati a -20 ° C o utilizzato immediatamente. E &#39;importante per diluire il DNA 1:50 in acqua priva di nucleasi prima di utilizzarlo nella successiva reazione di PCR. In alternativa, il DNA può essere estratto con un qualsiasi numero di protocolli standard di estrazione del DNA (Zijlstra et al., 2002). </li><li> Il DNA umano è rilevato nei tessuti pulcino con PCR quantitativa specifica per l&#39;uomo sequenze Alu. PCR quantitativa utilizzando Alu-primer specifico viene eseguita utilizzando l&#39;amplificazione SYBR green dal exract-N-Amp kit. Il kit PCR viene fornito con una miscela di reazione contenente 2x SYBR green, tampone, sali dNTP, Taq polimerasi e l&#39;anticorpo Jumpstart Taq. La miscela di reazione è costituita in un volume finale di 15μl, con 0.4μM di ciascun primer. Per la maggior parte dei casi utilizzando il DNA estratto diluito 1:50 fornirà dati quantitativi, tuttavia, la quantità ottimale di DNA stampo può essere necessario ottimizzare empiricamente. Pollo primer GAPDH sono utilizzati come controllo interno è gestito La PCR nelle seguenti condizioni per le sequenze Alu: attivazione della polimerasi a 95 ° C per 2 minuti seguiti da 30 cicli a 95 ° C per 30 secondi, 63 ° C per 30 s. , 72 ° C per 30 s. Le condizioni di reazione per il pollo GAPDH sono identiche a quelle descritte per Alu tuttavia, può essere necessario estendere la PCR a 40 cicli. </li><li> L&#39;analisi quantitativa di metastasi viene eseguita utilizzando il metodo del confronto ΔΔCt gruppi sperimentali ad un gruppo di controllo (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). In alternativa una curva standard può essere generato usando una serie di diluizioni di cellule tumorali umane estratte utilizzando il Extract-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). La significatività statistica viene valutata utilizzando Student t-test o analisi Anova di controllo e di gruppi sperimentali. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Il modello di embrione di pollo metastasi. A) Un pannello di quattro diagramma illustra l&#39;aspetto del modello in sezione trasversale a fasi principali: 1. Dopo 10 giorni di incubazione. Il CAM ha raggiunto quasi le dimensioni massime. Le arterie e le vene sono nettamente visibili con la vena allantoide posizionato contro la parte superiore dell&#39;uovo. 2. L&#39;uovo subito dopo la foratura due fori nel guscio d&#39;uovo: uno nell&#39;altro airsac e adiacente al punto di attacco per la vena allantoideo uno. 3. L&#39;aspetto dopo un vuoto dolce è stato utilizzato per evacuare l&#39;airsac e rilasciare il CAM. Cellule tumorali (blu) vengono applicate alla CAM caduto. 4. Dopo aver consentito al innestato cellule tumorali a crescere, il tumore con tessuti dai embrione di pollo vengono raccolti per l&#39;analisi B) Una rappresentazione di serie del modello: 1.. L&#39;incubazione delle uova., 2. Segnando la posizione della vena allantoide., 3. I fori nel guscio d&#39;uovo., 4. Cadere la CAM., 5. Taglio di apertura per l&#39;innesto delle cellule tumorali., 6. Applicando le cellule tumorali., 7. Raffreddamento le uova sul ghiaccio prima della raccolta del tessuto., 8. La raccolta del tumore dopo 7 giorni di crescita. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Istologia dei tumori CAM. I tessuti prelevati da membrana cuscinetto tumore corioallantoidea è stato fissato in formalina, sezionati e trattati con una macchia tricromica. A) HEP3 tumore dopo sette giorni di crescita sul CAM. B e C mostrano regioni magnificato dalla A mostrare sia del tumore e stroma. D) normali CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Analisi quantitativa longitudinale di metastasi. Varianti per la testa e il collo con carcinoma HEP3 alta o bassa capacità metastatica (HEP3 M (High) e HEP3 M (basso), rispettivamente) sono stati analizzati per la loro capacità di diffondere tramite Alu PCR. Dieci animali sono stati analizzati in ogni punto volta per la durata di 7 giorni. Questi campioni sono stati quantificati contro una curva standard e successivamente espressa # cells/50mg tessuti. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. L&#39;inibizione delle cellule metastasi spontanee negli animali trattati con l&#39;anticorpo 1A5 inibire le metastasi. I tumori si sono formati utilizzando 5X10 5 HEP3 cellule applicato al CAM del giorno-10 embrioni. Tre giorni dopo l&#39;applicazione delle cellule tumorali sono state trattate metà degli animali con l&#39;anticorpo anti-CD151 1A5. I polmoni di animali portatori di tumore sono state raccolte due giorni dopo e sottoposto a restrizioni quantitative real-time PCR alluminio. Al contrario quantitativa real-time PCR di chGAPDH è stata utilizzata per confermare la presenza di quantità equivalenti di DNA genomico ospite (ΔΔCt Il metodo è stato utilizzato per confrontare i due gruppi quantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Valutare l&#39;arresto, la crescita, e intravasation nella cascata metastatica. Fondamentalmente, le metastasi di un organo secondario è definito dal contributo di tre aspetti: l&#39;arresto, il tasso di crescita, e il tasso di intravasation. Questi possono essere quantificati utilizzando una combinazione di metastasi sperimentali (A) e metastasi spontanee (B). Utilizzando metastasi sperimentali (A) è definito come l&#39;arresto del numero di cellule rilevate 2 ore dopo l&#39;iniezione. Sopravvivenza e la crescita delle cellule arrestato è determinato come la variazione di iniezione numero di cellule 24 ore dopo. La crescita è definito come il tasso di proliferazione nei giorni 3-7. Intravasation è determinato utilizzando metastasi spontanee (B), dove il numero di cellule intravasated è definito come l&#39;attuale carico metastatico il giorno 7 che supera il valore previsto dalla crescita degli oneri metastatico presenti il ​​giorno 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Espansione visualizzazione delle metastasi nel CAM. HEP3 cellule che esprimono GFP sono state iniettate per via endovenosa in 12 giorni di sviluppo. Il giorno 1, 3 e 5 è stato sacrificato un uovo e una sezione di CAM è stato ripreso con uno stereo microscopio a fluorescenza. Lo sfondo verde scuro viene creata dal guscio d&#39;uovo, il sistema vascolare è visibile come linee nere, e le cellule tumorali sono visibili come macchie verdi brillanti.

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	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li><li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment.">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+(PETA-3/CD151)+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis.">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il CAM pulcino è stato utilizzato per decenni come sistema modello per studiare vari aspetti della biologia del cancro e nella progressione metastatica. Valutazione principio della capacità metastatica sono stati effettuati in questo modello da una varietà di gruppi, tra cui l&#39;analisi di dormienza (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), rimodellamento dei tessuti (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999), e le metastasi (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) (1X), liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) 4NA con EDTA, liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Questi incubatori sono alcuni tra i più facilmente reperibili. Tuttavia, il video mostrerà diverse apparecchiature. </td></tr><tr><td> Sportsman incubatore </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel utensile rotante </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ruote di taglio Dremel no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Portatile Pipettare aiuti </td><td> Pescatore </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Cotone Tipped Applicatori </td><td> Pescatore </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Le uova fecondate </td><td> Vari </td><td></td><td> Molti vendor differenti possono essere utilizzati. Le uova devono essere di circa 35-55 grammi. Le galline che li pone dovrebbe essere compresa tra 36 e 55 settimane di età. </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser scientifico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica microscopio illuminatore </td><td> Amscope </td><td> HL 250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 gauge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

Durante le cellule tumorali metastasi disseminare dal tumore primario, invadere i tessuti circostanti, e si diffuse in organi distanti. Metastasi è un processo complesso che può coinvolgere diversi tipi di tessuto, periodi lasso di tempo variabile, e spesso si verificano in profondità all&#39;interno degli organi, rendendo difficile indagare e quantificare. Inoltre, l&#39;efficacia del processo metastatico è influenzato da più passaggi nella cascata metastatica rendendo difficile valutare il contributo di un singolo aspetto del comportamento delle cellule tumorali. Di conseguenza, le analisi sono eseguite frequentemente metastasi negli animali da esperimento per fornire un contesto necessariamente realistica in cui studiare metastasi. Sfortunatamente, questi modelli sono ulteriormente complicata dalla loro fisiologia complessi. L&#39;embrione di pollo è un unico modello in vivo che supera molti limiti allo studio di metastasi, a causa della accessibilità della membrana corioallantoidea (CAM), una buona vascolarizzazione dei tessuti extra-embrionali trova sotto il guscio d&#39;uovo che è ricettivo ai xenotrapianto di cellule tumorali (figura 1). Inoltre, poiché l&#39;embrione di pollo è naturalmente immunodeficienti, il CAM supporta facilmente l&#39;attecchimento dei tessuti normali e tumorali. Soprattutto, il CAM aviaria supporta con successo le caratteristiche delle cellule tumorali tra cui la maggior parte della crescita, invasione, angiogenesi, e il rimodellamento del microambiente. Questo rende il modello particolarmente utile per lo studio delle vie che portano alla metastasi del cancro e di prevedere la risposta del tumore metastatico a nuovi potenziali terapie. La rilevazione di cellule diffusi da specie-specifico Alu PCR permette di valutare quantitativamente metastasi in organi che sono colonizzati da un minimo di 25 celle. Utilizzando la linea di carcinoma epidermoide umano (HEP3) usiamo questo modello per analizzare metastasi spontanea delle cellule tumorali in organi distanti, tra cui il pulcino fegato e polmoni. Inoltre, utilizzando la Alu-PCR protocollo dimostriamo la sensibilità e la riproducibilità del test come strumento per analizzare e quantificare intravasation, arresto, stravaso, e la colonizzazione come singoli elementi di metastasi.

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Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

L&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

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18.9K Views.  Vanderbilt University. Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

Video: Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Ricerca

Medicina

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualizzazione quantitativa e diagnosi del tumore della pelle utilizzando Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modelli di metastasi ossee

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

L'analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

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