この研究は、日本、スポーツ、科学技術、文化、教育省、ナショナルバイオリソースプロジェクトと協力して実施されました。

実験の全体的なスキームを図に示します。 1。 1。試薬の調製<ol><li>以下の表に応じて100mlのガラス瓶に、基本培地を（ここでPB1とも呼ばれる）を確認します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mMの </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><tD&gt;グルコース</td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> Naのピルビン酸</td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td>のCaCl 2、2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td>ペニシリンG </td><td></td><td></td><td> 6.0（約） </td></tr></tbody></table></li><li>フィコール - スクロース（FS）ソリューションを作成します。 <ol><li> 50 mlチューブにPB1ソリューション14mlのために、以下の化学物質を追加。 <table border="1"><tbody><tr><td>フィコール70 </td><td> 6.0グラム</td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 3.424グラム</td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0ミリグラム</td></tr></tbody></table></li><li>フィコール70およびPB1溶液中でのショ糖を混ぜて、完全に溶解するまでよく振る。 </li><li>上記の完全な溶解を確認した後、溶液の表面にBSAを追加し、それを根気よく続けるBSAするまで4℃で完全に（&gt; 4時間または一晩）に溶解する。 </li></ol></li><li> 50 mlチューブで平衡化溶液（EFS20）とガラス化液（EFS40）を行います。 <ul><li> EFS20：20％（v / v）のエチレングリコール、24％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.4モル/ Lのスクロース</li><li> EFS40：40％（v / v）のエチレングリコール、18％（w / v）のフィコール、とBSAとPB1の0.3モル/ L *スクロース 彼らは6 cryodamageに敏感なので、* BALB / cまたはICR系統の胚は、0.9モル/ Lショ糖にショ糖の濃度を増加させる。 </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20ソリューション </td><td> EFS40ソリューション </td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td> 1ミリリットル</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td> FSのソリューション</td><td> 4ミリリットル</td><td> 3ミリリットル</td></tr></tbody></table></li><li> 0.45μmのfilteを使用してろ過により溶液を滅菌R. 4℃で5ミリリットルポリスチレンチューブとストア内のアリコートを作る℃に彼らは約6ヶ月間使用することができます。 </li><li> 0.75 Mスクロース（TS1）を含む胚融解液の調製<ol><li> PB1のショ糖（ステップ1.1で調製したもの）の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 </li><li>表面上に溶液をBSAの90 mgを追加し、完全に溶解するまでそれはスタンドのまま。 </li><li>ろ過により溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol> 注：TS1はまた市販のM2から調製することができます。 <ol start="6"><li> M2のショ糖の7.7 gを溶かし、30 mlに、総容積をもたらす。 </li><li>ショ糖が完全に溶解するまで穏やかに振盪して混合します。 </li><li>ろ過により溶液を滅菌する。 </li><li> 4℃で分注し店。彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol></li><li> TS2（解凍ソリューション：0.25 Mショ糖）を含む<ol><li>必要に応じて、PB1またはM2の20mlの量で10ml TS1を希釈する。 </li><li> 4℃で分注し店彼らは約1ヶ月間使用することができます。 </li></ol></li></ol> 2。 2セルのマウス胚のガラス化<ol><li> 体外受精の技術で自然交配あるいは従来で2細胞マウス胚を準備します。 </li><li>クライオチューブに分注し50μlのEFS40を。以後、常温でガラス化の手順の残りを実行します。 </li><li> 35ミリメートル以上60ミリメートルのプラスチックペトリ皿の底にEFS20物のアリコートを50μl。 </li><li>培地のみの最小限の量でガラスキャピラリーを使用してEFS20に30胚まで転送する。 2分間タイマーを開始します。 注：ドロップの底の上に置いて胚。これは、胚の効率的な脱水を行います。実体顕微鏡による胚の形態を確認してください。 図に示すように脱水胚は、縮小形態を示す。 2A。彼らは十分に脱水されていない場合は、1以上または2分間待つ。 </li><li>約1.5分で、ソリューションののみ最小限のEFS20ドロップから胚を拾う。ステップ2.1で作成したクライオチューブにEFS40にそれらを転送する。注：最良の結果を得るためには、全ての胚が約2分間でEFS40に転送できるように、胚を拾うのタイミングを調整する。 </li><li> 1分間待ちます。 </li><li>液体窒素（LN 2）に直接クライオチューブを置く。 </li></ol> 3。ビトリファイド2セルのマウス胚を融解<ol><li>解凍する前に、回収された胚の胚培養の培地10μlの滴（ステップ3.13を参照）で料理を準備。使用するまでCO 2インキュベーター内でオイルと場所との皿に蓋をする。注：ルーチン胚培養のためのあらゆるメディアがこの実験で使用されるかもしれませんが、我々はそのようなM16媒体として高い浸透圧でメディアをお勧めします。 </li><li> 37℃にTS1を温める</li><li>フェイスマスクとcryoglovesに置く。 LN 2 tを開きます。ANKと胚を含むクライオチューブを取り出す。 </li><li>すぐにチューブの上部を開き、LN 2を捨てる。次のステップで凍結からTS1を防ぐために30秒間待ちます。 </li><li>チューブにTS1（37℃）850μlを加え、溶液が均一に溶解するまで穏やかpipettings（25秒で約10倍）で溶液を混合する1000ulピペットを使用してください。 </li><li>プラスチック製の60ミリメートルペトリ皿（または時計皿）（ 図3A）にチューブのボリューム全体を転送する。注：彼らはステップ3.14でCO 2インキュベーター内に配置されるまで胚を室温（22〜25℃）で処理する必要があります。 </li><li> 3分間タイマーを開始します。 </li><li>胚を含む培地をシャーレの表面（ 図3B）に分散されるまで、TS1で約2分で、ゆっくりと料理を振る。注：これはTS1に転送するときに彼らは表面近くに浮遊しているので、胚が一番下まで行くのに役立つ。 </li><li>目の上にTS2の三​​50μlの滴を入れてE皿（ 図3C）。 </li><li> TS1の3分後、実体顕微鏡による胚の形態を確認して、彼らは少し縮んだすべきである。 TS1で以前の胚の形態（ 図2B）を参照して 、後で（ 図2C）。注：胚がまだ腫れている場合は、3分〜1詳しくは、TS1に保管してください。 </li><li>胚を拾うとTS2の最初のドロップ（ 図3D）に移す。 3分間タイマーを起動します。 </li><li> 3分後、3番目のドロップ（ 図3E）に2番目のドロップに胚を移すと。 </li><li>ステップ3.1で調製した培地に胚を移す。胚は、 図に示すような形状になります。 2D。 </li><li> CO 2インキュベーター内での場所の皿。約10分後、TS2から引き継がれているショ糖を洗い流すための培地の横にあるドロップに胚を移す。 </li><li>胚移植まで、CO2インキュベーターで培養を継続。 注：転送ブリー解凍の日に受取人の女性の卵管にOS。 in vitroでの長い文化は、マウスの一部の菌株における胚の生存率が低下する場合があります。 </li></ol> 4。代表的な結果： 解凍は、表1と表2に示されており、胚の in vivo開発の後で- in vitroで 。このプロトコルの利点は、マウスの異なる系統に解凍し、その広範な適用後の胚の高い生存性があります。 <table border="1"><tbody><tr><td>ひずみ</td><td>チューブの合計数</td><td>ガラス化胚の数</td><td> （番号（％））を回収</td><td>形態的に正常（第（％）） </td><td>胚盤胞への開発（第（％）） </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397（99） </td><td> 394（99） </td><td> 342（87） </td></tr><tr><td> BALB / cAの</td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296（99） </td><td> 282（95） </td><td> 238（84） </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474（99） </td><td> 443（93） </td><td> 398（90） </td></tr></tbody></table> 表1。一般的なマウス系統におけるガラス化融解胚の体外開発で <table border="1"><tbody><tr><td>胚の状態</td><td>受信者女性の数</td><td>転送された胚の数</td><td>着床部位（番号（％）） </td><td>子孫を生きる（第（％）） </td></tr><tr><td>新鮮な</td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141（78.3） </td><td> 110（61.1） </td></tr><tr><td>ガラス固化</td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202（83.5） </td><td> 125（51.7） </td></tr></tbody></table> 表2。C57BL/6Jマウスにおけるガラス化融解後の胚のin vivoで開発中 。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> 図1。胚の平衡化、ガラス化、融解を含む実験の全体的なスキーム。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> 図2凍結融解の各段階で胚の形態。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> 図3。胚の手順を解凍。すべての手順は室温で実施されています。 （）、クライオチューブにTS1（37℃）850μlを加え、プラスチック製の皿にクライオチューブ内の溶液のボリューム全体を転送する。この時点では、胚は、 図1のように腫れて見える。 2B。 （B）、軽く揺することで皿の表面上にソリューションを広げる。 （C）、プラスチック製の皿にTS2の三​​50μlの滴を入れます。 （D）、TS2の最初のドロップに胚を移す。 図に示すように3分後、胚はshurunken見える。 2C。 （E）、それらをシリアル転送残りのTS2の滴にし、培養培地にLY。

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	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

1985年2におけるRallとFahyによるマウス胚のガラス化の最初の報告以来、いくつかの技術的改良が融解後の胚の生存性を高めるために行われています。最も成功した変更の一つは、その低毒性と高い膜透過性の凍結保護剤としてエチレングリコールを使用することによって達成された。このような利点は、私たちは、室温4℃凍結胚を処理することができますが、他のガラス化法は、クーラーの温度で渡す胚を必要とし、常にBALB / cの6を含むマウスのいくつかの株には適用されません。第一エチレングリコールベースの​​ガラス化は、笠井らによって開発されました。 1990年5,7インチオリジナルのメソッドはコンテナとしてプラスチック製のストロー用に最適化されているので、我々は若干の研究室でより簡単にアクセスし、物理的な損害に対してより耐性があるクリオチューブ、のためのプロトコルを変更しました。したがって、ここで説明するガラス化法は、アプリケーション可能性があります研究のモデルとしてマウスを用いた多くの研究室にlicable。同じ方法は、桑実胚と胚盤胞の段階8およびラットの胚9時、マウスの胚にも使用できます。しかし、我々は最近、クリオチューブの質が凍結融解後の胚の生存率に影響を与える可能性があることを発見した。従って、それはガラス化胚（;特定の試薬や機器の表で参照など）の前にその滑らかさのためにクリオチューブの内側表面を調べるために不可欠です。 ガラス化法は、従来の緩慢凍結法に比べて多くの利点がありますが、それらは本質的に輸送の目的に関しての欠点を有している。ガラス固化体胚を° Cがその生存を維持するために、以下の-120で保管されるべきであるとして、ドライシッパーは、一般的にそれらの安全輸送に使用されます。特に国際輸送のために、ドライシッパーは重くてかさばるであり、その往復は高価です。我々は、現在で新しいガラス化法を開発していますそのガラス固化体の胚は少なくとも7日間10分間ドライアイス温度（-80℃程度）で保存することができる。このメソッドは、次の世代のガラス化する必要があります。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルクバイオサイエンス（Calbiochem社） </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>和光純薬</td><td> 058から00986 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール70 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>和光純薬</td><td> 041から00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>和光純薬</td><td> 191から01665 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>和光純薬</td><td> 163から03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td>和光純薬</td><td> 169から04245 </td><td></td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 · 12H 2 </sUB&gt; O </td><td>和光純薬</td><td> 500から04195 </td><td></td></tr><tr><td>のMgCl 2 · 6H 2 O </td><td>和光純薬</td><td> 135から00165 </td><td></td></tr><tr><td>のCaCl 2 · 2H2O </td><td>和光純薬</td><td> 031から00435 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P - 4687 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P - 8574 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>和光純薬</td><td> 196から00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>住友ベークライト</td><td> MS - 4501 </td><td> &quot;極低温バイアル&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

マウス胚の凍結保存は、マウスの多くの菌株は遺伝的改変によって生成されており、数は一貫して年々増加しているため、生物医科学をサポートする技術基盤です。その技術開発は、その後1980年代後半2で開発されたガラス化法に続いて、1970年代1で緩慢凍結の方法で起動しています。一般に、後者の技法は、その迅速、シンプル、そして回収された胚の高い生存性に有利である。しかし、含まれる凍結保護剤は、非常に有毒であり、その後の胚発生に影響を及ぼす可能性があります。したがって、技術のソリューションを4に冷却されている場合でも、マウスの特定の系統に適用できませんでした° C胚の処理中に毒性影響を軽減する。理研バイオリソースセンターでは、異なる遺伝的背景と表現型と5000以上のマウス系統では3を維持しているため、我々は、ガラス化TEを最適化して我々は周囲温度4でガラス化して（またはより正確に、液化）融解後の高い胚の生存の利点と、マウスの多くの異なる株から胚を凍結保存することができるとchnique。 ここで、我々が正常に当センターで使用されているマウスの胚のガラス化法を提案する。凍結保存液は、胚を5に毒性を最小限にする代わりにDMSOのエチレングリコールが含まれています。また、それぞれ、フィコールと失透と浸透圧調整の防止のためのショ糖が含まれています。胚は、室温で処理し、5分以内に液体窒素に転送することができます。オリジナルのメソッドはコンテナとしてプラスチック製のストロー用に最適化されているので、我々は若干の研究室でより簡単にアクセスし、物理的な損害に対してより耐性があるクリオチューブ、のためのプロトコルを変更しました。それが重要なステレオなので、我々はまた、詳細にガラス化胚の融解の手順を説明生きたマウスの効率的な回収のためのp。これらの手法は、安全かつ費用効果の高い方法で後で使用するためのマウス系統の保存を必要とする研究者や技術者に参考になる。

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

マウスの胚のエチレングリコールベースの​​ガラス化法が説明されています。それは、そのシンプルさと低胚毒性の他の方法に有利であるため、近交系や遺伝子改変マウスを含むマウスの多くの株、に広く適用することができます。

エチレングリコール系ガラス化によるマウス胚の凍結保存

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

30.8K ビュー.  RIKEN BioResource Center. マウスの胚のエチレングリコールベースの​​ガラス化法が説明されています。それは、そのシンプルさと低胚毒性の他の方法に有利であるため、近交系や遺伝子改変マウスを含むマウスの多くの株、に広く適用することができます。

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPCのマウス胚の解剖

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

生物学

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

コレクションとハムスターの卵母細胞とマウス胚の凍結保存

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

移植によるキメラゼブラフィッシュ胚の生成

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

着床前の牛の胚、羊、ヤギの凍結保存

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

して、古いニワトリ胚への遺伝子導入<em&gt; EX OVO</em&gt;エレクトロポレーション

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...