Cette étude a été menée en collaboration avec le Projet national de bioressources, le Ministère de l&#39;Education, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon.

Le schéma global de l&#39;expérience est montré dans la Fig. 1. 1. Préparation des réactifs <ol><li> Rendre le milieu de base (ici en tant que connue PB1) dans une bouteille de verre de 100 ml selon le tableau ci-dessous: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glucose </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Pyruvate de Na </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> La pénicilline G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (environ) </td></tr></tbody></table></li><li> Faites le Ficoll-sucrose (FS) solution: <ol><li> Ajouter les substances chimiques suivantes à 14 ml de PB1 solution dans un tube de 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mélanger Ficoll 70 et du saccharose dans PB1 solution et bien agiter jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Après vérification de la dissolution complète ci-dessus, ajouter la BSA sur la surface de la solution et le conserver à4oC jusqu&#39;à ce BSA est complètement dissous (&gt; 4 heures ou jusqu&#39;au lendemain). </li></ol></li><li> Faire la solution d&#39;équilibrage (EFS20) et la solution de vitrification (EFS40) dans un tube de 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v) d&#39;éthylène glycol, 24% (p / v) de Ficoll, et de 0,4 mol / L de saccharose dans PB1 avec BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v) d&#39;éthylène glycol, 18% (p / v) de Ficoll, et de 0,3 mol / L de saccharose * en PB1 avec BSA * Pour les embryons de la souche BALB / c ou ICR, augmenter la concentration de saccharose à 0,9 mol / L de saccharose, car ils sont plus sensibles aux cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 solution </td><td> EFS40 solution </td></tr><tr><td> L&#39;éthylène glycol </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Solution de FS </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Stériliser la solution par filtration en utilisant une filte 0,45 umR. Faire aliquotes dans des tubes de 5 ml en polystyrène et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ 6 mois. </li><li> Préparation de la solution d&#39;embryon dégel contenant 0,75 M de saccharose (TS1) <ol><li> Dissoudre 7,7 g de saccharose dans PB1 (préparé à l&#39;étape 1.1) et porter le volume total à 30 ml. Mélanger en secouant doucement jusqu&#39;à complète dissolution du saccharose. </li><li> Ajoutez 90 mg de BSA sur la surface de la solution et laisser reposer jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Stériliser la solution par filtration. </li><li> Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol> Note: TS1 peuvent également être préparés à partir de M2 ​​disponibles commercialement. <ol start="6"><li> Dissoudre 7,7 g de saccharose dans M2 et porter le volume total à 30 ml. </li><li> Mélanger en secouant doucement jusqu&#39;à complète dissolution du saccharose. </li><li> Stériliser la solution par filtration. </li><li> Aliquoter et stocker à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol></li><li> TS2 (solution dégelcontenant 0,25 M de saccharose): <ol><li> Diluer 10 ml avec 20 volumes TS1 ml de PB1 ou M2, le cas échéant. </li><li> Aliquoter et conserver à 4 ° C. Ils peuvent être utilisés pendant environ un mois. </li></ol></li></ol> 2. La vitrification d&#39;embryons de souris à 2 cellules <ol><li> Préparer deux cellules d&#39;embryons de souris par accouplement naturel ou conventionnel dans les techniques de fécondation in vitro. </li><li> Aliquote de 50 ul EFS40 dans un cryotube. Ci-après, exécuter le reste de la procédure de vitrification à la température ambiante. </li><li> Aliquote de 50 pl d&#39;EFS20 sur le fond de 35 mm ou 60 mm en plastique plat de Pétri. </li><li> Transfert jusqu&#39;à 30 embryons à l&#39;aide d&#39;un EFS20 capillaire en verre avec seulement le montant minimum du milieu de culture. Démarrer une minuterie pendant 2 min. Remarque: les embryons Placer sur le fond de la goutte. Cela rend efficacité de la déshydratation des embryons. Vérifiez la morphologie des embryons par un stéréomicroscope. Embryons déshydratés montrent une morphologie ratatinée, comme indiqué dans la Fig. 2A.Si elles ne sont pas déshydratés assez d&#39;attendre pour plus d&#39;1 ou 2 min. </li><li> À environ 1,5 min, ramasser les embryons dans le menu déroulant EFS20 avec seulement le montant minimum de la solution. Transférez-les dans le cryotube EFS40 préparé en 2,1 étapes. Note: Pour les meilleurs résultats, ajuster le calendrier de ramasser des embryons de telle sorte que tous les embryons peuvent être transférés dans EFS40 à environ 2 min. </li><li> Attendre 1 min. </li><li> Mettez le cryotube directement dans l&#39;azote liquide (LN2). </li></ol> 3. La décongélation des embryons de souris vitrifié 2-cellules <ol><li> Avant de décongélation, préparer un plat avec 10 gouttes ul de milieu de culture embryonnaire des embryons récupérés (voir l&#39;étape 3.13). Couvrir le plat avec de l&#39;huile et placer dans un incubateur à CO 2 jusqu&#39;à son utilisation. Note: Bien que tous les médias pour la culture d&#39;embryons de routine peuvent être utilisées dans cette expérience, nous recommandons médias avec plus osmolarité tel que le milieu M16. </li><li> TS1 chaud à 37 ° C. </li><li> Mettez un masque visage et cryogloves. Ouvrez la LN 2 tank et récupérer un cryotube contenant des embryons. </li><li> Ouvrir rapidement le haut du tube et jeter LN 2. Attendre 30 secondes pour éviter le gel des TS1 à l&#39;étape suivante. </li><li> Utiliser une pipette 1000ul d&#39;ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans le tube et mélanger la solution par pipetages douce (environ dix fois en 25 secondes) jusqu&#39;à ce que la solution est uniformément dissoute. </li><li> Transférer la totalité du volume du tube pour un plat en plastique de 60 mm de Pétri (ou un verre de montre) (figure 3A). Remarque: Les embryons doivent être manipulés à la température ambiante (22-25 ° C) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient placés dans un incubateur à CO 2 à l&#39;étape 3.14. </li><li> Démarrer une minuterie pendant 3 min. </li><li> A environ 2 min dans TS1, secouez doucement la parabole jusqu&#39;à le milieu contenant les embryons est étalé sur la surface de la parabole (figure 3B). Note: Ceci aidera les embryons vont vers le bas parce qu&#39;ils sont flottants près de la surface lors de son transfert à TS1. </li><li> Mettez trois gouttes de 50 pl d&#39;TS2 sur ee plat (figure 3C). </li><li> Après 3 min dans TS1, vérifier la morphologie des embryons par un stéréomicroscope, ils devraient être légèrement rétrécie. Voir la morphologie des embryons en plus tôt (figure 2B) et plus tard (figure 2C) en TS1. Remarque: Si les embryons sont encore gonflées, les garder dans TS1 pour plus de 1 à 3 min. </li><li> Ramassez les embryons et les transférer à la première goutte de TS2 (Fig. 3D). Démarrer une minuterie pendant 3 min </li><li> Après 3 minutes, le transfert des embryons à la baisse de secondes, puis à la troisième baisse (Fig. 3E). </li><li> Transfert des embryons dans le milieu de culture préparé à l&#39;étape 3.1. Les embryons sont dans la forme représentée dans la Fig. 2D. </li><li> Placez-vaisselle dans un incubateur à CO 2. Environ 10 minutes plus tard, le transfert des embryons à la baisse prochaine du milieu de culture pour laver le saccharose qui a été reporté de TS2. </li><li> Poursuivre la culture dans un incubateur à CO2 jusqu&#39;au transfert d&#39;embryon. Remarque: Le transfert EmbryOS pour les oviductes des femelles receveuses au jour de décongélation. Longue culture in vitro peut diminuer la viabilité des embryons chez certaines souches de souris. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: In vitro - et in vivo-développement des embryons après décongélation est présenté dans les tableaux 1 et 2. Les avantages de ce protocole sont les chances de survie élevé d&#39;embryons après décongélation et son large applicabilité à différentes souches de souris. <table border="1"><tbody><tr><td> Souche </td><td> Nombre total de tubes </td><td> No. d&#39;embryons vitrifiés </td><td> Réformé (n ° (%)) </td><td> Morphologiquement normaux (n ° (%)) </td><td> Développement d&#39;blastocystes (n ° (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / ca </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tableau 1. In vitro-développement de vitrifiés et décongelés embryons dans des souches de souris commune <table border="1"><tbody><tr><td> Condition d&#39;embryons </td><td> Nombre de femelles receveuses </td><td> No. d&#39;embryons transférés </td><td> Sites d&#39;implantation (n ° (%)) </td><td> Des jeunes vivants (n ° (%)) </td></tr><tr><td> Fraîches </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrifié </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tableau 2. In vivo, le développement des vitrifiés et décongelés embryons chez des souris C57BL/6J. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Figure 1. Le schéma d&#39;ensemble de l&#39;expérience, y compris l&#39;équilibration, la vitrification, et la décongélation des embryons. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Figure 2. La morphologie des embryons à chaque étape de décongélation. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Figure 3. Dégel procédure d&#39;embryons. Toutes les procédures sont réalisées à température ambiante. (A), ajouter 850 l de TS1 (37 ° C) dans un cryotube et le transfert de la totalité du volume de la solution dans le cryotube sur un plat en plastique. A cette époque, les embryons chercher gonflées comme indiqué dans la Fig. 2B. (B), étaler la solution sur la surface du plat en le secouant doucement. (C), 50 gouttes Placer trois pl d&#39;TS2 sur le plat en plastique. (D), le transfert des embryons pour la première goutte de TS2. Après 3 minutes, les embryons chercher shurunken comme indiqué dans la Fig. 2C. (E), les transférer sériement dans le reste TS2 gouttes et puis au milieu de culture.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

Depuis le premier rapport de la vitrification des embryons de souris par Rall et Fahy, en 1985, 2, plusieurs améliorations techniques ont été faits pour accroître la capacité de survie des embryons après décongélation. Une des modifications les plus réussies a été atteint par l&#39;utilisation de l&#39;éthylène glycol comme un cryoprotecteur en raison de sa faible toxicité et de haute perméabilité membranaire. Ces avantages nous permettent de gérer la congélation d&#39;embryons à 4 température ambiante; méthodes de vitrification d&#39;embryons d&#39;autres nécessitent la remise à des températures plus fraîches et ne sont pas toujours applicables à certaines souches de souris dont BALB / c 6. Vitrification à base de glycol d&#39;éthylène Le premier a été développé par Kasai et al. en 1990 5,7. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Par conséquent, la méthode de vitrification décrites ici peuvent être applicable à plusieurs laboratoires utilisant des souris comme modèles de recherche. La même méthode peut également être utilisé pour les embryons de souris à la morula et blastocyste étapes 8 et 9 embryons de rat. Toutefois, nous avons récemment constaté que la qualité des cryotubes peuvent affecter le taux de survie des embryons après congélation-décongélation. Ainsi, il est essentiel d&#39;examiner la surface intérieure de la cryotubes pour sa finesse, avant vitrification des embryons (par exemple, voir au tableau des réactifs spécifiques et les équipements). Méthodes de vitrification ont de nombreux avantages sur les méthodes classiques de congélation lente, mais ils ont intrinsèquement un désavantage par rapport à fin de transport. Comme embryons vitrifiés devrait être maintenu au-dessous de -120 ° C pour maintenir leur viabilité, les expéditeurs secs sont généralement utilisés pour leur transport sécuritaire. Expéditeurs à sec sont lourds et encombrants, et de leur voyage aller-retour coûte cher, surtout pour le transport international. Nous sommes maintenant en train de développer une nouvelle méthode de vitrification pardont les embryons vitrifiés peut être conservé à la température de la glace sèche (environ -80 ° C) pendant au moins 7 jours 10. Cette méthode devrait être la vitrification de la prochaine génération.

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthylène glycol </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 · 2H2O </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Wako Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 moyennes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu M2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> «Fiole cryogénique&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Cryoconservation des embryons de souris est une base technologique qui soutient les sciences biomédicales, car de nombreuses souches de souris ont été produites par des modifications génétiques et le nombre est en augmentation constante d&#39;année en année. Son développement technique a commencé avec méthodes de congélation lente dans les années 1970 1, puis suivie par des méthodes de vitrification développé à la fin des années 1980 2. Généralement, cette dernière technique est avantageuse dans sa rapidité, la simplicité et la survivabilité élevée d&#39;embryons récupérés. Cependant, le contenu cryoprotecteurs sont très toxiques et peuvent affecter le développement embryonnaire ultérieur. Par conséquent, la technique n&#39;est pas applicable à certaines souches de souris, même lorsque les solutions sont refroidies à 4 ° C afin d&#39;atténuer l&#39;effet toxique lors de la manipulation d&#39;embryons. Au Centre RIKEN bioressources, plus de 5000 souches de souris avec différents fonds génétiques et les phénotypes sont maintenues 3, et donc nous avons optimisé une TE de vitrificationchnique avec laquelle nous pouvons cryoconserver embryons de nombreuses souches différentes de souris, avec les avantages de survie des embryons après vitrification haute et la décongélation (ou liquéfaction, plus précisément) à la température ambiante 4. Ici, nous présentons une méthode de vitrification des embryons de souris qui a été utilisé avec succès dans notre centre. La solution contient de l&#39;éthylène glycol cryoconservation au lieu de DMSO pour minimiser la toxicité pour les embryons 5. Il contient également de Ficoll et de sucrose pour la prévention de dévitrification et l&#39;ajustement osmotique, respectivement. Les embryons peuvent être manipulés à la température ambiante et transféré dans l&#39;azote liquide dans les 5 min. Parce que la méthode originale a été optimisé pour les pailles en plastique comme les conteneurs, nous avons légèrement modifié le protocole pour cryotubes, qui sont plus facilement accessibles dans les laboratoires et les plus résistants aux dommages physiques. Nous décrivons également la procédure de décongélation des embryons vitrifiés en détail parce que c&#39;est un ste critiquesp pour la récupération efficace des souris vivantes. Ces méthodologies serait utile aux chercheurs et aux techniciens qui ont besoin de préservation de souches de souris pour une utilisation ultérieure d&#39;une manière sûre et rentable.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Une base d&#39;éthylène glycol méthode de vitrification des embryons de souris est décrite. Il est avantageux à d&#39;autres méthodes dans sa simplicité et une faible toxicité embryonnaire, et ne peut donc être largement applicable à de nombreuses souches de souris, y compris les souris consanguines et génétiquement modifiées.

Cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

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Biologie

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

En injection intraventriculaire Utero et l&#39;électroporation d&#39;embryons de souris E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

Interférences ARNi par injection dans les ARNdb Drosophile Embryons

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transfert de gènes dans des embryons de poulet âgés par<em&gt; Ex ovo</em&gt; Électroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...