وقد أجريت هذه الدراسة بالتعاون مع مشروع BioResource الوطني ، وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.

يتم عرض الخطة الشاملة للتجربة في الشكل. 1. 1. تحضير كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المتوسطة قاعدة (المعروف هنا في PB1) في قنينة زجاج 100 مل وفقا للجدول التالي أدناه : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ميغاواط </td><td> ملي </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> غ هبو 2 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 ، 6H 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><tد&gt; الجلوكوز </td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> غ البيروفات </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2 ، 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> البنسلين G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (تقريبا) </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل Ficoll - السكروز (FS) الحل : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المواد الكيميائية التالية إلى 14 مل من محلول PB1 في أنبوب 50 مل. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 ز </td></tr><tr><td> السكروز </td><td> 3،424 ز </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 ملغ </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج Ficoll 70 و السكروز في حل PB1 ويهز جيدا حتى يذوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التحقق من استكمال حل أعلاه ، إضافة جيش صرب البوسنة على السطح من الحل والحفاظ عليه فييذوب تماما حتى 4oC BSA (&gt; 4 ساعات أو بين عشية وضحاها). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجعل الحل القائم على موازنة (EFS20) والحل التزجيج (EFS40) في أنبوب 50 مل : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS20 : ​​20 ٪ (V / V) جلايكول الإثيلين ، و 24 ٪ (W / V) Ficoll ، و 0.4 مول / لتر في PB1 السكروز مع جيش صرب البوسنة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EFS40 : 40 ٪ (V / V) جلايكول الإثيلين ، و 18 ٪ (W / V) Ficoll ، و 0.3 السكروز * مول / لتر في PB1 مع جيش صرب البوسنة * بالنسبة للأجنة من سلالة BALB / ج أو مجلس النواب ، وزيادة تركيز السكروز إلى السكروز مول / لتر 0.9 لأنهم أكثر حساسية لcryodamage 6. </li></ul><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 الحل </td><td> EFS40 الحل </td></tr><tr><td> الاثيلين غليكول </td><td> 1 مل </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> FS الحل </td><td> 4 مل </td><td> 3 مل </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحل عن طريق الترشيح باستخدام filte 0.45 ميكرونر. جعل aliquots في 5 مل أنابيب البوليسترين وتخزينها في 4 درجات مئوية. يمكن استخدامها لمدة 6 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل الجنين تحتوي على ذوبان السكروز 0.75 M (TS1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 7.7 غرام من السكروز في PB1 (أعدت في الخطوة 1.1) وجلب الحجم الإجمالي إلى 30 مل. مزيج لطيف من قبل يهز حتى يذوب تماما السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 90 ملغ من جيش صرب البوسنة على سطح الحل وترك الأمر حتى حل الموقف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحل عن طريق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر. </li></ol> ملاحظة : يمكن أيضا أن تكون مستعدة من TS1 M2 متاحة تجاريا. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 7.7 غرام من السكروز في M2 وجلب الحجم الإجمالي إلى 30 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج لطيف من قبل يهز حتى يذوب تماما السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الحل عن طريق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وتخزينها في 4oC. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TS2 (حل ذوبانتحتوي على السكروز 0.25 م) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 10 مل TS1 مع حجم 20 مل من PB1 أو M2 ، حسب الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر. </li></ol></li></ol> 2. التزجيج من أجنة الفئران 2 - الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 إعداد الخلايا من الأجنة الماوس التزاوج الطبيعية أو التقليدية في تقنيات التلقيح الصناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة EFS40 50 ميكروليتر إلى cryotube. الآخرة ، تنفيذ بقية الإجراء التزجيج في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 50 ميكرولتر من EFS20 على الجزء السفلي من 35 ملم أو 60 ملم طبق بيتري البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ما يصل إلى 30 إلى الأجنة EFS20 باستخدام الزجاج الشعرية مع المبلغ فقط الحد الأدنى من الثقافة المتوسطة. بدء الموقت لمدة 2 دقيقة. ملاحظة : ضع الأجنة في الجزء السفلي من الهبوط. وهذا يجعل الجفاف كفاءة الأجنة. التحقق من مورفولوجية الأجنة قبل stereomicroscope. الأجنة المجففة تظهر التشكل منكمشة ، كما هو موضح في الشكل. 2A.إذا لم تكن كافية المجففة ، والانتظار لمزيد من 1 أو 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 1.5 دقيقة ، والتقاط الأجنة من الهبوط EFS20 مع المبلغ فقط الحد الأدنى من الحل. نقلها إلى EFS40 في cryotube أعد 2.1 الخطوة. ملاحظة : للحصول على أفضل النتائج ، ضبط توقيت التقاط الأجنة بحيث يمكن نقل كل الأجنة في EFS40 حوالي 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع cryotube مباشرة في النيتروجين السائل (LN 2). </li></ol> 3. ذوبان المزججة أجنة الفئران 2 - الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ذوبان الجليد ، وإعداد الطبق مع 10 قطرات ميكرولتر من مستنبت الجنين للأجنة المستردة (راجع الخطوة 3.13). تغطية صحن مع الزيت وضعها في حاضنة 2 CO حتى الاستخدام. ملاحظة : على الرغم من يمكن استخدام أي وسيلة إعلامية للثقافة الجنين روتينية في هذه التجربة ، فإننا نوصي وسائل الاعلام مع ارتفاع متوسط ​​الأسمولية مثل M16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TS1 الدافئة إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الوجه والقناع cryogloves. فتح 2 ر LNكرانك واسترداد cryotube تحتوي على أجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح بسرعة أعلى من الأنبوب وتجاهل LN 2. الانتظار لمدة 30 ثانية لمنع TS1 من التجمد في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة 1000ul لإضافة 850 ميكرولتر من TS1 (37 درجة مئوية) في أنبوب ومزيج الحل بواسطة pipettings اللطيف (حوالي عشر مرات في 25 ثواني) حتى يتم حل بالتساوي الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجم نقل كامل للأنبوب من البلاستيك على طبق بيتري 60 ملم (أو الزجاج مشاهدة) (الشكل 3A). ملاحظة : يجب التعامل مع الأجنة في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) حتى يتم وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في الخطوة 2 3.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الموقت لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند حوالي 2 دقيقة في TS1 ، يهز بلطف الطبق حتى يتم نشر المتوسطة التي تحتوي على أجنة على سطح الطبق (الشكل 3B). ملاحظة : هذا سوف يساعد على الأجنة النزول إلى أسفل لأنها تطفو قرب السطح عندما نقل إلى TS1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت ثلاثة ميكرولتر من 50 نقطة على عشرة TS2ه طبق (الشكل 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 دقائق في TS1 ، والتحقق من التشكل للأجنة قبل stereomicroscope ، وينبغي أن تقلصت قليلا. راجع مورفولوجية الأجنة في وقت سابق (الشكل 2B) وبعد (الشكل 2C) في TS1. ملاحظة : إذا كنت لا تزال منتفخة الأجنة ، والاحتفاظ بها في TS1 لمزيد من 1-3 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الأجنة ونقلها إلى أول قطرة من TS2 (الشكل 3D). بدء الموقت لمدة 3 دقائق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 دقائق ، ونقل الأجنة إلى الانخفاض الثاني ، ثم إلى الانخفاض الثالث (الشكل 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى مستنبت أعدت في الخطوة 3.1. الأجنة في الشكل المبين في الشكل. 2D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق مكان في حاضنة 2 CO. حوالي 10 دقيقة في وقت لاحق ، ونقل الأجنة إلى الانخفاض القادم من مستنبت لغسل السكروز التي تم ترحيلها من TS2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل الثقافة في حاضنة CO2 حتى نقل الأجنة. ملاحظة : نقل جنينالسراج للناقلة البيضات من الإناث المتلقية يوم الذوبان. قد ثقافة طويلة في المختبر تقليل قابلية للأجنة في بعض سلالات من الفئران. </li></ol> 4. ممثل النتائج : في المختبر -- والتنمية في الجسم الحي للأجنة بعد عرض ذوبان الجليد في الجدولين 1 و 2. مزايا هذا البروتوكول هي البقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة بعد ذوبان الجليد وتطبيقه واسع النطاق لسلالات مختلفة من الفئران. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> سلالة </td><td> إجمالي عدد الأنابيب </td><td> عدد الأجنة المزجج </td><td> المستردة (رقم (٪)) </td><td> شكليا العادية (رقم (٪)) </td><td> التنمية لblastocysts (رقم (٪)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> مجلس النواب </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> الجدول 1. وفي تطور المختبر من المزجج ، المذوبة الأجنة في سلالات الفأر المشتركة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حالة الأجنة </td><td> عدد الإناث المتلقية </td><td> نقل عدد الأجنة </td><td> مواقع الغرس (رقم (٪)) </td><td> يعيش ذرية (رقم (٪)) </td></tr><tr><td> جديد </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> المزجج </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> الجدول 2 ، وفي تنمية الجسم الحي من المزجج ، المذوبة الأجنة في الفئران C57BL/6J. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> الشكل 1، والخطة الشاملة للتجربة بما في ذلك موازنة ، التزجيج ، وذوبان للاجنة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> الشكل 2 ، ومورفولوجية الأجنة في كل خطوة من الذوبان. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> الشكل 3. ذوبان الداخلي للاجنة. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة. (أ) ، أضف 850 ميكروليتر من TS1 (37 درجة مئوية) في cryotube ونقل وحدة التخزين بالكامل من الحل في cryotube على طبق من البلاستيك. في هذا الوقت ، تبدو منتفخة الأجنة كما هو مبين في الشكل. 2B. (B) ، ونشر حل على سطح الطبق عن طريق هز لطيف. (C) ، ضع ثلاثة ميكرولتر من 50 نقطة TS2 على طبق من البلاستيك. (D) ، نقل الأجنة إلى الانخفاض الأول من TS2. بعد 3 دقائق ، والأجنة تبدو shurunken كما هو موضح في الشكل. 2C. (E) ، نقل منهم التسلسليلاي في TS2 المتبقية قطرات ثم إلى متوسطة الثقافة.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

منذ صدور التقرير الأول من التزجيج الجنين الماوس بواسطة RALL وفاهي 2 في عام 1985 ، أدخلت تحسينات تقنية عديدة لزيادة البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد الذوبان. وقد حققت واحدة من أنجح التعديلات عن طريق استخدام جلايكول الإثيلين باعتبارها cryoprotectant بسبب سميتها المنخفضة والعالية النفاذية غشاء. هذه المزايا تتيح لنا للتعامل مع تجميد الاجنة في درجة حرارة الغرفة (4) ؛ التزجيج أساليب أخرى تتطلب تسليم الجنين في درجات الحرارة وبرودة ليست دائما تنطبق على بعض سلالات من الفئران بما BALB / ج 6. تم تطوير الاثيلين غليكول first التزجيج المستندة إلى كاساي وآخرون. في عام 1990 5،7. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. لذا ، قد يكون أسلوب التزجيج الموصوفة هنا يكون التطبيقlicable إلى العديد من المختبرات باستخدام الفئران كنماذج البحوث. ويمكن أيضا أن تكون نفس الطريقة المستخدمة لأجنة فئران في مراحل morula والكيسة أجنة الفئران 8 و 9. ومع ذلك ، فقد وجدنا مؤخرا أن نوعية cryotubes قد تؤثر على معدلات البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد ذوبان التجميد. وهكذا ، فإنه لا بد من دراسة سطح داخل cryotubes لسلاسة في الأجنة قبل التزجيج (على سبيل المثال ، انظر الجدول في الكواشف محددة والمعدات). أساليب التزجيج لها مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية التجميد البطيء ، ولكن لديهم أصلا في وضع غير موات بالنسبة لغرض النقل. كما ينبغي أن تبقى في الأجنة المزجج أدناه -120 درجة مئوية للحفاظ على بقائها ، وهي تستخدم عادة لنقل الشحن الجاف بشكل آمن. الشاحنين جافة ثقيلة وضخمة ، ولها ذهابا وإيابا أمر مكلف ، وخصوصا في النقل الدولي. نحن الآن حاليا بتطوير أسلوب التزجيج جديدةوالتي يمكن أن تكون مخزنة في الأجنة المزجج الجليد الجاف في درجة الحرارة (نحو -80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 7 أيام 10. هذا الأسلوب يجب أن يكون التزجيج للجيل القادم.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> ميرك العلوم البيولوجية (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> الاثيلين غليكول </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> بوكل </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> غ 2 هبو 4 · 12H 2 </sUB&gt; O </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> 2 · MgCl 6H 2 O </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين G </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 4687 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم البيروفات </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P - 8574 </td><td></td></tr><tr><td> السكروز </td><td> واكو الصرفة للصناعات الكيماوية </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 المتوسطة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 المتوسطة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> سوميتومو الباكليت </td><td> MS - 4501 </td><td> &quot;فيال المبردة&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران هي أساس التكنولوجية التي تدعم علوم الطب الحيوي ، لأنه قد تم إنتاج العديد من سلالات الفئران التي كتبها التعديلات الجينية وعدد يتزايد باستمرار عاما بعد عام. بدأ تطوره التقني مع أساليب التجميد البطيء في 1 1970s ، وأعقب ذلك من خلال طرائق التزجيج وضعت في أواخر 1980s 2. عموما ، والأسلوب الأخير هو مفيد لها في السرعة والبساطة ، والبقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة المسترجعة. ومع ذلك ، فإن cryoprotectants الواردة سامة للغاية ويمكن أن تؤثر على تطور الجنين اللاحقة. ولذلك ، فإن الأسلوب لا ينطبق على سلالات معينة من الفئران ، وحتى عندما يتم تبريد الحلول إلى 4 درجات مئوية للتخفيف من آثار سامة خلال التعامل مع الجنين. في مركز BioResource بتبريد ، تمسك الماوس سلالات أكثر من 5000 مع خلفيات وراثية مختلفة ، والظواهر 3 ، وبالتالي لدينا الأمثل a التزجيج الشركة المصرية للاتصالاتchnique التي يمكننا cryopreserve أجنة من سلالات مختلفة من الفئران ، مع بقاء الجنين فوائد مرتفعة بعد التزجيج والذوبان (أو تسييل ، وأكثر تحديدا) في درجة حرارة الغرفة 4. هنا ، نقدم أسلوب التزجيج للأجنة الفئران التي تم استخدامها بنجاح في مركزنا. الحل الحفظ بالتبريد يحتوي على غليكول الاثيلين بدلا من DMSO لتقليل السمية للأجنة 5. كما أنه يحتوي على Ficoll والسكروز للوقاية من devitrification والتكيف التناضحي ، على التوالي. ويمكن معالجة الأجنة في درجة حرارة الغرفة ونقل الى النيتروجين السائل في غضون 5 دقائق. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. وصفنا الداخلي أيضا ذوبان الأجنة المزجج بالتفصيل لأنها حاسمة الظريفع لاستعادة كفاءة من الفئران الحية. وهذه المنهجيات تكون مفيدة للباحثين والفنيين الذين يحتاجون إلى الحفاظ على السلالات الماوس لاستخدامها لاحقا بطريقة آمنة وفعالة من حيث التكلفة.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification at JoVE.com

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

وصفت والاثيلين جلايكول المستندة إلى أسلوب التزجيج لأجنة الفئران. فإنه من المفيد إلى أساليب أخرى في بساطتها والسمية الجنينية منخفضة ، وبالتالي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من سلالات من الفئران ، بما في ذلك الفئران الفطرية والجينات المعدلة.

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

30.8K Views.  RIKEN BioResource Center. وصفت والاثيلين جلايكول المستندة إلى أسلوب التزجيج لأجنة الفئران. فإنه من المفيد إلى أساليب أخرى في بساطتها والسمية الجنينية منخفضة ، وبالتالي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من سلالات من الفئران ، بما في ذلك الفئران الفطرية والجينات المعدلة.

Video: Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

تشريح 6.5 أجنة الفئران DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation من أجنة الفئران E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

توليد الأجنة اسماك الزرد همي بواسطة زرع

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

الحفظ بالتبريد سابق للانغراس الجنين من الأبقار والأغنام والماعز

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل<em&gt; OVO السابقين</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...