我々のプロトコルは単一細胞マウスの胚から容易、効率的に、そして急速に遺伝子組み換えマウスの準備を促進する。当社のプロトコルは、凍結解凍された1細胞段階の胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせることで、突然変異マウスを含む遺伝子組み換えマウスを高効率かつ低モザイク率で迅速に生成することができます。体外受精の場合、妊娠したマレ血清ゴナドトロピンの7.5国際単位の腹腔内注射を介して4または8週齢の雌C57BL/6Jマウスをスーパー排卵し、その後48時間後に7.5の国際ヒト絨毛性ゴナドトロピンを腹腔内注射することから始める。
次に、性成熟した3〜5ヶ月の雄C57BL/6Jマウスからカウダ精巣上体を取り除き、解剖針を使用して精子の血栓を抽出する。その後、200マイクロリットルのHTFの滴下で37°C、5%の二酸化炭素を1.5時間培養します。ヒト絨毛性ゴナドトロピン注射後16~18時間、卵管からcumulus卵母細胞複合体を採取し、液体パラフィンで覆われた200マイクロリットルのHTFで複合体をインキュベートし、細胞培養インキュベーターで2時間以下の培養を行う。
インキュベーションの終わりに、インキュベーション培地の境界からcumulus oocyte複合体の200マイクロリットルの滴に精子懸濁液を1〜5マイクロリットル加え、細胞培養インキュベーターに3時間共培養する。インキュベーションの終わりに、卵母細胞を単純な最適化培地を添加したカリウムで3回洗い、残りの精子とcumulus細胞を取り除き、逆顕微鏡を使用して1つの細胞胚の前核形成とグレードを確認する。1つの細胞胚凍結保存のために、細胞培養インキュベーター中の10分間のインキュベーションのために20%の胎児ウシ血清を補充したHTFの新鮮な200マイクロリットルの滴に胚を移す。
インキュベーションの終わりに、20〜100個の胚を1つのモルジメチルスルホキシド溶液の50マイクロリットルに移し、5マイクロリットルの溶液中の最大100個の胚をクライオチューブの底に移します。チューブの側面に45マイクロリットルのDAP213溶液を加える前に、胚を摂氏ゼロ度で5分間冷却します。キャッピング後、液体窒素にチューブを素早く貯蔵する前に、セルをさらに摂氏0度で5分間保持します。
CRISPR RNAのマイクロリットル当たり1マイクログラム、および低血清最小必須培地でtracrRNAのマイクロリットルあたり1マイクログラムを調製します。各RNA溶液の6マイクロリットルを42マイクロリットルのヌクレアーゼフリーバッファーに加え、95°Cで3分間ドライヒーターに入れます。インキュベーションの終わりに、室温で混合物を5分間冷却し、血清最低必須培地を減らしてHiFi Cas9タンパク質のマイクロリットル当たり1マイクログラムを調製します。
希釈したHiFi Cas9溶液の6マイクロリットルをRNA溶液に加え、1つのガラススライド全体で得られたリボヌクレオタンパク質複合体溶液の25マイクロリットルに最大100個の解凍胚を移します。その後、37°Cで10分間胚をインキュベートします。胚エレクトロポレーションの場合、インキュベーションの終了時に、エレクトロポレーターパラメータを設定し、スライドをエレクトロポレーターにロードします。
エレクトロポレーションは、DNAの最初の複製の前にゲノム編集が起こることを確実にし、モザイクを防ぐために、胚の解凍から1時間以内に行われるべきである。エレクトロポレーション後、2回の洗浄で2つの媒体を2回洗浄して、液体パラフィンで覆われた単純な最適化培地を補充したカリウムを2回洗浄して、胚を3回洗浄します。次に、細胞培養インキュベーターで一晩、新鮮なカリウム補充シンプレックス最適化培地で胚をインキュベートする。
この改変凍結保存法を用いて、一細胞胚の凍結融解胚の発生速度を2細胞段階まで改善する。この方法を用いて、この代表的な実験で生成されたすべてのマウスは、白と黒のパッチを持つコートを持つ1つのモザイクマウスを持つアルビノであった。ここでM1アレスレを含むアルビノマウスからのクロマトグラムの代表的な部分が観察できる。
図示したように、このプロトコルは、高効率で低いモザイクレートでノックアウトマウスとノックインマウスを生成することができます。実際、ホモ接合F0子孫のF1子孫は、変異体1種と異種変異を持たない野生型アレーレを含むヘテロ接合である。受精卵は一細胞の段階で壊れやすいということを忘れないでください。
胎児ウシ血清の添加は、胚を強化する。ただし、各ステップで慎重に処理する必要があります。この方法は、遺伝子組み換えマウスをより迅速かつ効率的に産生させることにより、ヒト疾患における遺伝子機能の解析や研究に寄与することができる。
