Данное исследование было проведено в сотрудничестве с Национальным проектом биоресурсов, Министерство образования, культуры, спорта, науки и технологий, Япония.

Общая схема эксперимента приведена на рис. 1. 1. Подготовка реагентов <ol><li> Сделать базу среде (здесь в известный как PB1) в 100 мл стеклянную бутылку в соответствии со следующей таблице ниже: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> МВт </td><td> мМ </td><td> мг/100мл </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><tг&gt; Глюкоза </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na пирувата </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Пенициллин G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (приблизительно) </td></tr></tbody></table></li><li> Сделать Ficoll-сахарозы (FS) решение: <ol><li> Добавить следующие химические вещества до 14 мл PB1 решение в 50 мл трубки. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 г </td></tr><tr><td> Сахароза </td><td> 3,424 г </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 мг </td></tr></tbody></table></li><li> Смешайте Ficoll 70 и сахарозы в PB1 решения и взболтать до полного растворения. </li><li> После проверки полного растворения выше, добавить BSA на поверхности раствора и держать его на4 ° С до BSA полностью растворяется (&gt; 4 часа или на ночь). </li></ol></li><li> Сделать уравновешивания раствора (EFS20) и стеклования решение (EFS40) в 50 мл трубки: <ul><li> EFS20: 20% (объем / объем) этиленгликоль, 24% (вес / объем) Ficoll и 0,4 моль / л сахарозы в PB1 с BSA </li><li> EFS40: 40% (объем / объем) этиленгликоль, 18% (вес / объем) Ficoll и 0,3 моль / л * сахарозы в PB1 с BSA * Для получения эмбрионов из штамма BALB / с или ICR, повышают концентрацию сахарозы до 0,9 моль / л сахарозы, потому что они более чувствительны к криоповреждения 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 решение </td><td> EFS40 решение </td></tr><tr><td> Этиленгликоль </td><td> 1 мл </td><td> 2 мл </td></tr><tr><td> FS решение </td><td> 4 мл </td><td> 3 мл </td></tr></tbody></table></li><li> Стерилизовать раствор фильтрации с использованием 0,45 мкм filteг. Сделать аликвоты в 5 мл пробирки полистирола и хранить при 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 6 месяцев. </li><li> Подготовка эмбриона оттаивания раствора, содержащего 0,75 М сахарозы (TS1) <ol><li> Растворите 7,7 г сахарозы в PB1 (подготовлен в шаге 1.1) и довести общий объем до 30 мл. Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится. </li><li> Добавить 90 мг BSA на поверхность раствором и оставьте стоять до полного растворения. </li><li> Стерилизовать раствор путем фильтрации. </li><li> Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. </li></ol> Примечание: TS1 также могут быть получены из имеющихся в продаже М2. <ol start="6"><li> Растворите 7,7 г сахарозы в М2 и довести общий объем до 30 мл. </li><li> Смешать, осторожно встряхивая, пока сахарозы полностью не растворится. </li><li> Стерилизовать раствор путем фильтрации. </li><li> Алиготе и хранить при температуре 4 °. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. </li></ol></li><li> TS2 (оттаивания решениесодержащем 0,25 М сахароза): <ol><li> Развести 10 мл TS1 с 20 мл объема PB1 или M2, по мере необходимости. </li><li> Алиготе и хранить при температуре 4 ° C. Они могут быть использованы в течение 1 месяца. </li></ol></li></ol> 2. Остекловывание 2-клетки эмбрионов мыши <ol><li> Подготовка 2-клетка эмбриона мыши, естественного спаривания или обычный в технике искусственного оплодотворения. </li><li> Алиготе 50 мкл EFS40 в криоскопической пробирки. Здесь и далее выполнять остальные стеклования процедуру при комнатной температуре. </li><li> Алиготе 50 мкл EFS20 в нижней части 35 мм или 60 мм пластиковые чашки Петри. </li><li> Трансфер до 30 эмбрионов EFS20 использованием стеклянный капилляр только с минимальным количеством питательной среды. Начало таймер на 2 мин. Примечание: Место эмбрионов в нижней части капли. Это делает эффективным обезвоживание эмбрионов. Проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа. Обезвоженная эмбрионов показать сморщенные морфологии, как показано на рис. 2А.Если они не будут достаточно обезвоженная, ждать больше 1 или 2 мин. </li><li> Примерно в 1,5 мин, забрать эмбрионов из EFS20 падение только с минимальным количеством раствора. Передача их в EFS40 криоскопической пробирки подготовлен в шаге 2.1. Примечание: Для достижения наилучших результатов, корректировать сроки подбирая эмбрионы так, что все эмбрионы могут быть перенесены в EFS40 около 2 мин. </li><li> Подождите 1 мин. </li><li> Положите криоскопической пробирки непосредственно в жидкий азот (LN 2). </li></ol> 3. Размораживание керамические 2-клетки эмбрионов мыши <ol><li> Перед оттаиванием, готовить блюда по 10 мкл капли эмбриона питательной среды для восстановленных эмбрионов (см. шаг 3.13). Обложка блюдо с маслом и поставить в CO 2 инкубаторе до использования. Примечание: Несмотря на любых носителях для рутинных культуры эмбриона могут быть использованы в этом опыте, мы рекомендуем средства массовой информации с более высокой осмолярности, такие как средний М16. </li><li> Теплый TS1 до 37 ° C. </li><li> Наденьте маску и cryogloves. Открытое Л. Н. 2 тАНК и извлекать криоскопической пробирки содержащие эмбрионов. </li><li> Быстро открывает верхней части трубки и отбросить LN 2. Подождите 30 секунд, чтобы предотвратить TS1 от замерзания на следующий шаг. </li><li> Используйте 1000ul пипетки добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в трубку и перемешать раствор, осторожно pipettings (примерно в десять раз в 25 секунд), пока раствор равномерно растворились. </li><li> Передача весь объем трубки 60 мм пластиковые чашки Петри (или часовое стекло) (рис. 3А). Примечание: Эмбрионы должны обрабатываться при комнатной температуре (22-25 ° С), пока они не помещаются в CO 2 инкубаторе на шаге 3.14. </li><li> Начало таймер на 3 мин. </li><li> Около 2 мин в TS1, встряхните блюдо, пока среда, содержащая эмбрионы распространяется на поверхности чашки (рис. 3В). Примечание: Это поможет эмбрионов спуститься на дно, потому что они плавают у поверхности при передаче на TS1. </li><li> Положите три 50 мкл капли TS2 на гоэлектронной блюдо (рис. 3в). </li><li> Через 3 минуты в TS1, проверьте морфология эмбрионов путем стереомикроскопа, они должны быть слегка сморщенным. Смотрите морфология эмбрионов в предыдущих (рис. 2В) и выше (рис. 2) в TS1. Примечание: Если эмбрионов до сих пор опухший, держать их в TS1 более 1 до 3 мин. </li><li> Возьмите эмбрионов и передавать их в первую каплю TS2 (рис. 3D). Начало таймер на 3 мин </li><li> Через 3 минуты, передачи эмбрионов второго падения, а затем в третьем раскрывающемся (рис. 3Е). </li><li> Трансфер эмбрионов к культуральной среде подготовлена ​​на шаге 3.1. Эмбрионы в форму, показанную на рис. 2D. </li><li> Место блюдо в CO 2 инкубаторе. Около 10 минут спустя, передача эмбрионов на следующий капли культуральной среде, чтобы смыть сахарозы, которая была перенесена из TS2. </li><li> Продолжить культуры в CO2-инкубаторе до переноса эмбрионов. Примечание: Передача ЭмбриОС яйцеводы получателя самок на день оттаивания. Длинные культуры в пробирке может уменьшиться жизнеспособность эмбрионов в некоторых линий мышей. </li></ol> 4. Представитель Результаты: В пробирке - и в естественных условиях развития эмбрионов после оттаивания представлены в таблицах 1 и 2. Преимущества этого протокола высокой живучести эмбрионов после оттаивания и его широкое применение в различных штаммов мышей. <table border="1"><tbody><tr><td> Напряжение </td><td> Общее количество труб </td><td> Количество эмбрионов керамической </td><td> Восстановленные (№ (%)) </td><td> Морфологически нормальные (№ (%)) </td><td> Развитию бластоцист (№ (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / сА </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Экстракорпоральное развития керамических-размороженные эмбрионы в общих линий мышей <table border="1"><tbody><tr><td> Состояние эмбрионов </td><td> Количество получателей женщин </td><td> Количество эмбрионов </td><td> Имплантация сайтов (№ (%)) </td><td> Живая потомства (№ (%)) </td></tr><tr><td> Свежий </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Керамические </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Таблица 2. В естественных условиях развития керамических-размороженные эмбрионы мышей C57BL/6J. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Рисунок 1. Общая схема эксперимента в том числе равновесия, стеклование, и оттаивания эмбрионов. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Рисунок 2. Морфологии эмбрионов на каждом этапе размораживания. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Рисунок 3. Размораживание процедуры эмбрионы. Все процедуры проводятся при комнатной температуре. (А), добавить 850 мкл TS1 (37 ° С) в криоскопической пробирки и передача всего объема раствора в криоскопической пробирки на пластиковую тарелку. В это время эмбрионы выглядят опухшими, как показано на рис. 2B. (B), Spread решение по поверхности блюдо, осторожно встряхивая. (C), место три 50 мкл капли TS2 на пластиковые тарелки. (D), трансфер эмбрионов первой капли TS2. Через 3 минуты, эмбрионы выглядят shurunken, как показано на рис. 2C. (E), передачи их серийногоLy в оставшиеся TS2 капель, а затем в культуральной среде.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

С первым докладом мыши витрификации эмбриона Ралль и Fahy в 1985 году 2, ряд технических улучшений было сделано увеличить выживаемость эмбрионов после размораживания. Один из самых успешных модификаций было достигнуто за счет использования ЭГ, как криопротектора из-за его низкой токсичностью и высокой мембранной проницаемости. Такие преимущества позволяют нам справиться замораживания эмбрионов при комнатной температуре 4; другими методами витрификации эмбриона требует передачи при более низких температурах и не всегда применим к некоторым линий мышей в том числе BALB / с 6. Первый этиленгликоля основе стеклования был разработан Касаи и соавт. в 1990 году 5,7. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Таким образом, стеклование метод, описанный здесь, может быть приложениеlicable для многих лабораториях на мышах, как научные исследования моделей. Тот же метод может также использоваться для эмбрионов мыши на морулы и бластоцисты этапы 8 и 9 крысиных эмбрионов. Тем не менее, мы недавно обнаружили, что качество cryotubes может повлиять на выживаемость эмбрионов после замораживания-оттаивания. Таким образом, крайне важно для изучения внутренней поверхности cryotubes для ее гладкости перед витрификации эмбрионов (например, см. в таблице конкретных реагентов и оборудования). Витрификация методы имеют много преимуществ по сравнению с обычными методами медленного замораживания, но они по своей сути имеют невыгодное положение в отношении транспортировки цели. Как керамической эмбрионы должны храниться при температуре ниже -120 ° С для поддержания их жизнеспособности, сухой грузоотправителей, как правило, используются для их безопасной транспортировки. Сухой грузоотправителей тяжелы и громоздки, и их туда-обратно стоит дорого, особенно для международных перевозок. Сейчас мы находимся в настоящее время разрабатывает новый метод остекловывания покоторые керамической эмбрионы могут храниться при сухого льда температура (около -80 ° С) в течение не менее 7 дней 10. Этот метод должен быть остекловывания следующего поколения.

<table border="1"><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии (необязательно) </td></tr><tr><td> Бычий сывороточный альбумин </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Этиленгликоль </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Глюкоза </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sиЬ&gt; O </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллин G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Натрия пируват </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Сахароза </td><td> Вако Pure Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 среда </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> М2 среда </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Криоскопической пробирки </td><td> Sumitomo бакелита </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Криогенные флакон&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Криоконсервация эмбрионов мыши является технологической основой, поддерживающей биомедицинских наук, потому что много линий мышей были произведены генетические изменения и число постоянно увеличивается из года в год. Его техническое развитие началось с медленного замораживания методы в 1970-х годов 1, затем следуют стеклования методы, разработанные в конце 1980 года 2. Как правило, последний метод является выгодным в его быстрота, простота и высокая живучесть восстановленных эмбрионов. Тем не менее, криопротекторов содержащихся обладают высокой токсичностью и может повлиять на дальнейшее развитие эмбриона. Таким образом, техника не относится к определенной линий мышей, даже если решения охлаждают до 4 ° С для смягчения токсического действия во время обработки эмбрионов. В центре RIKEN биоресурсов, более 5000 мышей штаммов с различным генетическим фоном и фенотипы сохраняются 3, и, следовательно, мы оптимизировали стеклования тэchnique с которой мы можем cryopreserve эмбрионов из разных линий мышей, с преимуществами высокую выживаемость эмбрионов после витрификации и оттаивания (или сжижения, точнее) при температуре окружающей среды 4. Здесь мы представляем стеклования метод эмбрионов мыши, которая была успешно использована в нашем центре. Криоконсервация решение содержит этиленгликоль вместо ДМСО, чтобы минимизировать токсичности для эмбрионов 5. Он также содержит Ficoll и сахарозы для предотвращения расстеклование и осмотического регулировки, соответственно. Эмбрионы могут быть обработаны при комнатной температуре и переданы в жидком азоте в течение 5 мин. Потому что оригинальный метод был оптимизирован для пластиковой соломинки, как контейнеры, мы несколько изменили протокол для cryotubes, которые являются более доступными в лабораториях и более устойчивы к физическим повреждениям. Мы также описать процедуру оттаивания эмбрионов керамической подробно, потому что это критический стер для эффективного восстановления живых мышей. Эти методики будут полезны для исследователей и техников, которые нуждаются в сохранении мыши штаммов для дальнейшего использования в безопасных и экономически эффективным образом.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification at JoVE.com

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Этиленгликоль метода, основанного на стеклования для эмбрионов мыши описано. Это выгодно с другими методами в своей простоте и низкой эмбриональной токсичности, и, следовательно, могут быть широко применимы ко многим линий мышей, в том числе инбредных и генно-модифицированных мышей.

Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

cryopreservation-mouse-embryos-ethylene-glycol-based

Research

JoVE Journal

Biology

30.8K Views.  RIKEN BioResource Center. Этиленгликоль метода, основанного на стеклования для эмбрионов мыши описано. Это выгодно с другими методами в своей простоте и низкой эмбриональной токсичности, и, следовательно, могут быть широко применимы ко многим линий мышей, в том числе инбредных и генно...

Video: Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Препарирование 6,5 Эмбрионы DPC мышь

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero инъекций Внутрижелудочковая и электропорации E15 эмбрионов мыши

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Сбор и Криоконсервация ооцитов хомяка и мыши Эмбрионы

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Криоконсервация Предимплантационная Эмбрионы крупного рогатого скота, овец и коз

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Всего горы<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Перенос генов в старых куриных эмбрионов на<em&gt; Бывший ово</em&gt; Электропорация

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...