この方法は、大腸菌で発現しにくい遺伝子製品がどのように精製されるのかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR以外の酵素反応が担体ではなく、タンパク質精製のための一般的な用途が使用できることです。この方法は、レンサ球菌突然変異体におけるタンパク質精製に関する洞察を提供することができるが、他の微生物叢種にも鑑たることができる。
この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である山下真美子博士です。レンサ球菌変異体からのプライマー設計およびゲノムDNA抽出後、野生型レンサ球菌変異体およびGFC破壊ストレプトコッカス・ミュータンスゲノムをPCRテンプレートとして使用して最初のPCRを行う。調製したgtfC-フォワードおよびリバースプライマーおよびspc r-フォワードおよびリバースプライマーを使用して、gtfC遺伝子の下流部分を収容する領域およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を収容する領域を増幅する。
次いで、1%アガロースゲル上の各PCR産物をエレクトロフォレス化した。ゲルバンドカッターを使用して、ゲルからマイクロ遠心チューブに約1,000塩基対と2,000塩基対の所望のDNA断片を切除します。各チューブに500マイクロリットルの可溶化バッファーを加え、56°Cで10分間インキュベートしてゲルスライスを溶解します。
シリカ膜ベースのゲル抽出法を用いて断片を精製する。最初の PCR の産物を、ネストフォワードおよびネストされた逆のプライマーを含む PCR テンプレートとして使用して、2 番目の PCR を実行します。2番目のPCR産物が電気泳動で確認できない場合は、別のネストされたプライマーのペアを設計する必要があります。
アガロースゲル上のPCR混合物の5マイクロリットルのエレクトロフォレス。エチジウムブロマイドゲル染色像により約3,000塩基対の適当なアンプリコンの生成を確認し、原稿に従って進める。今、濃縮された第二PCR産物の5マイクロリットルを氷冷、有能な野生型レンサ球菌突然変異細胞の50マイクロリットルのアロクォートに混合し、以前に凍結した。
混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーション装置のキュベットチャンバーにキュベットを入れます。1.8キロボルト、600オーム、10マイクロファラドを2.5ミリ秒の単一の電気パルスを細胞に与えます。キュベットに500マイクロリットルの脳・心注入スープを加えます。
すぐに10〜100マイクロリットルの懸濁液を、スペチノマイシンを含む脳-心輸液オーガープレートに広げる。コロニーが十分に成長して拾われるまで、37°Cで2〜6日間プレートをインキュベートします。ストレプトコッカス・ミュータンスポリヒスチジンコード配列の生成後、原稿による分光マイシンを伴わない菌株および一晩の接種を組み込み、摂氏4度で10,000倍gで20分間細菌培養懸濁液を遠心分離する。
培養上清を3リットルガラスビーカーに移します。培養上清からタンパク質を濃縮するには、2リットルの上清を磁気攪拌機に置き、激しい攪拌を開始します。硫酸アンモニウム1、122グラムを加え、沈殿物を4時間または一晩にわたって摂氏4度で激しく攪拌して形成させます。次に。
硫酸アンモニウム沈殿液を摂氏4度で20分間15,000回沈殿させた。上清をデカントします。ヘラで、沈殿物を収集し、200ミリリットルのガラスビーカーに移します。
ペレットを35ミリリットルの結合バッファーに再懸濁します。次いで、約25ミリリットルの懸濁液を再生したセルロース透析管に移す。透析チューブを攪拌結合バッファーの 2.5 リットルに入れ、攪拌機の 4°C でサスペンションを透析します。
2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けてください。次に、チューブから透析したサスペンションを遠心分離チューブに移し、チューブを20,000倍gの遠心分離機に摂氏4度で10分間置きます。セクションろ過装置では、上清を0.2マイクロメートルの膜フィルターで注ぎ、フィルターを付けます。
濾液を75ミリリットルのフラスコに移します。濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きgtfSIを分画するために、まず固定化された金属親和性クロマトグラフィーを調製する。原稿に従って樹脂を平衡化した後、ホフマンピンチコックを閉じます。
フィルターした懸濁液を5ミリリットルのカラムに加え、スラリーを作ります。その後、残りの濾過された懸濁液にすべてのスラリーを移し、4°Cで30分間穏やかに混合物を渦巻きます。混合データを列にロードして戻します。
ホフマンピンチコックを開き、重力の流れでサスペンションを取り除きます。IMAC樹脂を20ミリリットルの結合バッファーで洗浄し、次いで、溶出バッファーの20ミリリットルを溶出して組換えgtfSIを得た。その後、遠心超濾過チューブに溶出液を積み込み、溶液を2,000回gで遠心分離し、溶液を濃縮して1〜5分間濃縮します。
濾液容器を空にし、15ミリリットルの貯蔵バッファーをチューブに加えます。サンプルを再び遠心分離し、さらに2回繰り返します。組換えgtfSI溶液は、最終的に約1ミリリットルに濃縮される。
濃縮物をマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度で保管します。残りの機能復元プロトコルを続行します。このプロトコルにおいて、アガロースゲル電気泳動は、第1PCRおよび第2PCRからの各アンプリコンのサイズが予測サイズに対応していることを示している。
ストレプトコッカスミュータンスコロニーは、第2のPCR産物で形質転換し、スペチノマイシンを含む脳心注入オーガープレートにメッキした。アガロースゲル上で実行されるコロニーPCR産物は、各アンプリコンが予測サイズであったことを示している。固定化された金属親和性クロマトグラフィーで精製されたタンパク質は、SDS-PAGEにより単一バンドとして観察された。
ウェスタンブロットは、抗ポリヒスチジン抗体を用いて行い、観察されたバンドが160キロダルトンの期待されるポリヒスチジンタグ付きタンパク質であることを確認した。スクロース由来のバイオフィルム形成能は、1%スクロースの存在下でチューブ壁に付着性バイオフィルムを形成したレンサ球菌変異体野生型およびレンサ球菌変異体His-gtfCでのみ見られた。これはレンサ球菌ミュータンスデルタgtfCでは認められなかった。
しかし、組換えgtfSIの25マイクログラムを添加すると、レンサ球菌ミュータンスデルタgtfCにおける接着性バイオフィルム形成能が回復した。この方法の成功は、第2のPCR増幅に依存するため、2番目のPCR産物は電気泳動によって確認されなければならない。すでに、この方法により得られたヒスチジン型タンパク質は、タンパク質相互作用などの機能性酸にも連結されている。
その開発後、この技術は遺伝子破壊と組み合わせて、微生物学の分野の研究者が遺伝子機能を探求する道を開いた。
