Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (5T32GM008275-22) e un americano comunione Heart Association predoctoral (a EAS), una Chimica-Biologia Fellowship interfaccia dal NIH (2T32GM071339-06A1) (MED); e sovvenzioni da parte NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), Il Ellison Medical Foundation e la Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation (per JS).

1. Espressione di Hsp104 <ol><li> Il plasmide utilizzato per la purificazione in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contiene la Hsp104 open-lettura telaio sotto il controllo del promotore inducibile trc 26. Il plasmide produce Hsp104 con un N-terminale suoi 6-tag che possono essere rimossi per scissione della proteasi TEV. Trasforma pPROEX-HTB-Hsp104 in codone ottimizzato E. coli BL21-CodonPlus RIL-cellule (Stratagene, Agilent Technologies) utilizzando una procedura tipica trasformazione batterica (per esempio in base alle istruzioni del produttore). E &#39;importante utilizzare un codone ottimizzato E. coli ceppo Hsp104 perché ha un pregiudizio insolito codone. </li><li> Inoculare una cultura 2XYT 100 ml (Ricetta USB.: 16g / l di peptone di caseina, 10 g / l estratto di lievito, 5 g / L di NaCl, pH 7,0) integrato con 100μg/mL ampicillina e cloramfenicolo 34μg/mL con trasformanti fresca e crescere overnight a 37 ° C con agitazione a 200gpm. </li><li> Inoculare 10 mL della cultura durante la notte in 6 X 1L 2XYT con 100μg/mL 34μg/mL ampicillina e cloramfenicolo in fiaschi 2L. Agitare a 250rpm a 37 ° C fino OD 600 = ,4-0,6. A smettere di tremare e ridurre la temperatura a 15 ° C. Consentono alle cellule di equilibrare unagitated per 30min nell&#39;incubatrice fino a raggiungere 15 ° C. Una volta a 15 ° C viene raggiunta indurre l&#39;espressione delle proteine ​​con l&#39;aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mm. Riprendi agitazione a 250rpm notte (12-16 ore). </li></ol> 2. Raccolta e lisi delle cellule <ol><li> Harvest cellule mediante centrifugazione (in un rotore preraffreddato) a 4.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un Sorvall RC 3BP centrifuga +). I passi successivi devono essere eseguiti immediatamente, perché Hsp104 attività è diminuito quando E. coli sono congelati. Inoltre, tutti i passi successivi devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 ° C. </li><li> Pellet cellulari risospendere in prechilled (su ghiaccio) 10 ml tampone di lisi (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 500mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 5 micron pepstatina A, completo cocktail inibitore della proteasi (1 EDTA senza tablet/50mL), e 2mM β-mercaptoetanolo). </li><li> Lisare le cellule con una stampa francese (Emulsiflex) omogeneizzatore che utilizza uno scambiatore di calore immerso in acqua ghiacciata. Prima dell&#39;uso, assicurarsi che tutti i grumi di cellule sono state solubilizzate. Dopo equilibrante omogeneizzatore con tampone di lisi, due passa attraverso il cilindro con una pressione di 15.000-18.000 psi è sufficiente per lisi completa. Se una stampa francese non è disponibile, l&#39;incubazione con lisozima seguita da sonicazione può essere utilizzato (vedi discussione). Salva un piccolo campione di cellule lisate per l&#39;analisi SDS-PAGE (1ml) (lisato in fig. 2). </li><li> Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 16.000 rpm per 20min a 4 ° C (usiamo un RC5C Sorvall centifuge +). Conservare il supernatante per la fase successiva e salvare un piccolo campione (1ml) di supernatante per SDS-PAGE analisi (Load Ni in fig. 2). </li></ol> 3. Hsp104 Purificazione <ol><li> Mix surnatante dal punto 2.4 con 12mL (2 ml Ni-Sepharose perle per 1L di cellule) del 50% impasto di buffer di lisi equilibrata Ni-Sepharose perline (GE). </li><li> Ruotare il campione lentamente per 3 ore a 4 ° C in modo tale che Ni-Sepharose rimane fluttuante e schiumare è ridotto al minimo. Tempi di incubazione più brevi sono possibili, ma diminuisce la resa. A 4 ° C in presenza di inibitori della proteasi, il degrado si verifica poco, e un 3 ore al Ni-Sepharose tempo di incubazione non diminuisce l&#39;attività del prodotto finale. Raccogliere Ni-Sepharose tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva un piccolo campione di surnatante per SDS-PAGE analisi (1ml) e scartare il resto (flusso Ni Thru (FT) in fig. 2). </li><li> Lavare i recuperate Ni-Sepharose con 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 20 mM imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo), 5 volumi di colonna tampone di lavaggio con KCl 1M per rimuovere i contaminanti legato elettrostaticamente a Hsp104, e 25 volumi di colonna di tampone di lavaggio. Raccogliere Ni-Sepharose dopo ogni lavaggio mediante centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Dopo ogni ciclo di lavaggio e centrifugazione, rimuovere tampone per aspirazione. </li><li> Per eluire Hsp104, mescolare Ni-Sepharose con 1 ml di tampone di eluizione (40mm HEPES-KOH pH 7,4, 150mm KCl, 20 mM MgCl 2, 2.5% (w / v) glicerolo, 350mm imidazolo, 2mM β-mercaptoetanolo) per 1 ml e Ni-Sepharose rotazione a 4 ° C per 20 minuti. L&#39;alta concentrazione imidazolo interrompe il suo tallone-Ni 6 interazione. Rimuovere Ni-Sepharose con colonne vuote 1,2 ml di spin (Bio-Rad) tramite centrifugazione per 2 minuti a 4 ° C a 2.000 rpm (centrifuga Eppendorf 5810R). Salva 1ml di eluato per SDS-PAGE analisi (eluato Ni in fig. 2). Per ogni litro di cellule, ~ 15 mg di Hsp104 si ottiene in questa fase. </li><li> Buffer eluato scambio in Buffer Q (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl 2, 50 mM NaCl) usando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore) 15 ml di unità concentratore centrifugo. In primo luogo, concentrato di proteine ​​di ~ 1,5 ml quindi aggiungere 14.5mL di tampone di Q per diluire proteina di 10 volte. Ripetere 3 volte per lo scambio di buffer. L&#39;aumento del pH e sale a bassa assicura che Hsp104 ha una carica negativa alto. </li><li> Purificare Hsp104 tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando un buffer equilibrato Q colonna Risorsa Q 6 ml (GE). Prima dell&#39;iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Ci avvaliamo di una portata di 1mL/min. Lavare via debolmente proteine ​​di legame con 1 volume colonna del 20% Buffer Q + (20 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 0,5 mm, 5mm MgCl 2, 1M NaCl). Eluire Hsp104 con sfumatura lineare (20% -50% Buffer Q +) più di 5 volumi di colonna (Fig. 3). Raccogliere frazioni da 1 ml. Hsp104 e la maggior parte delle varianti tipicamente eluire a ~ 400mm NaCl (31mS/cm). Salva campioni delle frazioni di picco (1ml) per SDS-PAGE analisi (Fig. 3, nel riquadro). </li><li> Per rimuovere la sua 6-tag, proteine ​​di scambio con il concentratore centrifugo Amicon come descritto sopra (vedi punto 3.5) nel buffer della scissione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, KCl 140mm, e 10mM MgCl 2). Usa proTEV proteasi (Promega) o AcTEV proteasi (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Per Hsp104, abbiamo trovato che il più alto rapporto di proteasi TEV: Hsp104 sono necessari per la scissione totale. Usiamo un rapporto di 1 unità di proteasi per 12μg Hsp104. Scissione deve essere eseguita a 30 ° C per 2-4 ore, seguita da una incubazione 16 ore a 4 ° C. Concentrazione finale Hsp104 dovrebbe essere tra 20-75μM monomero. Riducono le rimanenti Hsp104 His6 marcatura ed proteasi TEV con Ni-Sepharose (GE) con l&#39;aggiunta di Ni-Sepharose in eccesso alla quantità di Hsp104 nella reazione della scissione (assumere perle può legare 15 mg di proteina per ml di resina imballato). Rimuovere perline con colonne di rotazione vuoto (Bio-Rad) per centrifugazione per 2 minuti a 2.000 rpm a 4 ° C. Raccogliere i campioni prima e dopo la scissione (1ml) per SDS-PAGE analisi per garantire la scissione, e la rimozione delle proteine ​​uncleaved (Fig. 4). </li><li> Scambio in dimensione del buffer di esclusione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1 mM DTT) utilizzando MWCO 30.000 Amicon Ultra (Millipore), come descritto al punto 3.5. </li><li> Ulteriori purificare Hsp104 via dimensione-cromatografia di esclusione. Usa esclusione Superose dimensione del buffer equilibrata 6 o 200 Superdex colonna (sia da GE) (Fig. 5). Prima dell&#39;iniezione, la proteina viene filtrata attraverso un basso legame proteico Millex GP PES membrana 0.22μM siringa filtro (Millipore). Per meno di 10 mg di proteine, le colonne di dimensioni 10/300 (24ml) può essere utilizzato e le frazioni di 0,5 ml sono stati raccolti. Per i campioni maggiori di 10 mg, la colonna dimensione 12/60 (120ml) dovrebbe essere usato e 1 ml frazioni vengono raccolte. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per flussi e volumi di campione da caricare. Dopo la purificazione, frazioni Hsp104 sono riuniti come mostrato in fig. 5 e concentrata in Unità Concentratore Amicon centrifuga (Millipore). Hsp104 viene memorizzato come descritto di seguito. A causa della perdita di materiale a separare Hsp104 prodotti di degradazione e contaminanti la resa finale del purificata full-length Hsp104 è ~ 1-3mg per litro di partenza cultura. </li></ol> 4. Hsp104 Disaggregase attività <ol><li> Dopo la purificazione, è buona per valutare Hsp104 attività in un test di disgregazione. Tipicamente, ci avvaliamo di un saggio di luciferasi riattivazione 2 (Fig. 6). In questo saggio, Hsp104 in collaborazione con il sistema di chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) disaggrega urea-denaturato aggregati luciferasi lucciola 2. Solubile luciferasi catalizza l&#39;ossidazione della luciferina ad oxyluciferin, una reazione che libera la luce. Dalla luminescenza monitoraggio, la riattivazione relativa, e quindi disaggregazione, di luciferasi può essere determinato. Hsp104 deve essere in grado di collaborare in sinergia con il co-chaperone Hsp70 sistema. La quantità di luminescenza recuperato dipende dalla Hsp70 esatta: coppia Hsp40 utilizzati. Noi abitualmente utilizzano Hsp72 e Hsp40 (disegni Assay). Come minimo, attivo Hsp104 dovrebbe produrre un aumento di 5 volte nella riattivazione della luciferasi rispetto alla riattivazione di Hsp72: Hsp40 solo (Fig. 6). Hsp104 preparati che non riescono a raggiungere questo livello di attività vengono scartati. </li></ol> 5. Hsp104 archiviazione <ol><li> Per la conservazione a breve termine, Hsp104 può essere conservato a 4 ° C in formato esclusione buffer. Tuttavia, l&#39;attività si ridurrà dopo 2-3 giorni a 4 ° C e bruscamente dopo 1 settimana a 4 ° C. Per i saggi di disaggregazione si consiglia di Hsp104 deve essere utilizzato il più presto possibile dopo la purificazione. Idealmente, Hsp104 deve essere utilizzato immediatamente per le analisi disaggregazione amiloide. </li><li> Se le proteine ​​devono essere conservati a lungo termine, Hsp104 viene scambiato nella soluzione per la conservazione (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 140mm KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mm EDTA, 1mM DTT, 10% glicerolo (w / v)). Aliquote 100μl sono a scatto congelato in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Cicli di gelo-disgelo ridurre drasticamente Hsp104 attivitàe deve essere evitato. Si consiglia di scongelare lentamente Hsp104 sul ghiaccio. -Amiloide disaggregase attività si ridurrà drasticamente dopo 1 mese a -80 ° C. </li></ol> 6. Risultati Rappresentante e figure: <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Hsp104 è un disaggregase bifunzionali. Disaggregazione degli aggregati disordinati (mostrato a sinistra) richiede la cooperazione del sistema chaperone Hsp70 (Hsp70 e Hsp40) 2. Rimodella Hsp104 ordinato aggregati amiloidi (illustrato a destra) senza l&#39;ausilio di Hsp70 e Hsp40 in vitro, ma Hsp70 e Hsp40 può migliorare Hsp104 attività contro amiloide 26,28. Per entrambe le tipologie di strutture aggregate, Hsp104 coppie idrolisi dell&#39;ATP per traslocazione del substrato attraverso il suo canale centrale per promuovere disaggregazione. Tirosina-cuscinetto loop pori coinvolgere e substrato navetta attraverso il canale centrale 49-52. <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. SDS-PAGE analisi di Ni-sefarosio passo affinità purificazione. Lisato, carico Ni, Ni FT e campioni di eluato Ni sono stati frazionati mediante SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie . Si noti che non tutti i Hsp104 è in grado di legarsi al Ni-sefarosio. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono mostrati (corsia sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Risorsa purificazione Q di Ni-sefarosio eluato. Traccia blu rappresenta l&#39;assorbanza a 280 nm e traccia verde rappresenta% Buffer Q + (massimo al 50%). Il primo picco, che eluisce al 20% + Q contiene impurità, prodotti di degradazione e piegato impropriamente Hsp104. Il secondo picco e le principali contiene accuratamente piegati e attiva Hsp104. Portata era 1ml/min. Gradiente che va dal 20-50% Q + è di 30 minuti o 5 volumi di colonna. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. SDS-PAGE analisi del passo clivaggio della proteasi proTEV. Suoi 6-Hsp104 dalla purificazione delle risorse Q è stato trattato con proteasi proTEV per 4 ore a 30 ° C e poi 16 ore a 4 ° C. I campioni sono stati frazionati mediante la SDS-PAGE utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Si noti che proTEV spaccati Hsp104 migra più rapidamente. TEV proteasi e uncleaved Hsp104 sono state esaurite con batterie Ni-Sepharose come descritto al punto 3.7. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Taglia-esclusione di purificazione Hsp104. Spaccati Hsp104 è stato ulteriormente purificato attraverso una colonna 6 gel filtrazione Superose (10/300, GE). = Portata 0.4ml/min. Il picco tra le linee tratteggiate rappresentano frazioni pool. Riquadro: frazioni di picco vengono risolte mediante SDS-PAGE analisi utilizzando un 4-20% Tris-HCl 1,0 millimetri Criterion gel (Bio-Rad) e colorate Coomassie. Ampia Gamma di marcatori di peso molecolare (Bio-Rad) sono indicati (a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Saggio riattivazione luciferasi. Denaturato aggregati lucciola luciferasi (50nm) sono state incubate sia con Hsp72 e Hsp40 (1μM) (entrambi dal design Assay), Hsp104 (6μM monomero) o Hsp104, Hsp72 e Hsp40 per 90min a 25 ° C. Luciferasi denaturato è solo completamente riattivato in presenza di entrambi i Hsp104 e Hsp40/Hsp72. Luminescenza recuperato viene misurato su una piastra lettore Infinite M1000 (Tecan). Valori rappresentano le medie ± SEM (n = 3).

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Timeline: per la massima attività Hsp104 raccomandiamo che il sistema di purificazione intero essere completato il più rapidamente possibile. Tuttavia, il numero di passaggi di purificazione rende un programma impegnativo che non può sempre essere pratico. Se le fasi di purificazione vengono eseguite più rapidamente possibile, il tempo a partire dalla fine di espressione durante la notte fino alle 2-4 ore di incubazione a 30 ° C con proteasi TEV è di circa 9-11 ore. Un posto potenziale per mettere in pausa ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL cellule competenti </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT brodo </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Completi, mini, EDTA senza inibitori della proteasi compresse </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Un pepstatina </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 flusso veloce </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 unità centrifughe filtro (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Risorsa Q - colonna 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV proteasi </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV proteasi </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose sei 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 è un esamerica AAA + 1 da proteine ​​del lievito, che le coppie idrolisi dell&#39;ATP alle proteine ​​disaggregazione 2-10 (Fig. 1). Questa attività conferisce due vantaggi chiave selettiva. In primo luogo, rinaturazione di aggregati disordinati di Hsp104 consente la sopravvivenza di lievito, dopo varie sollecitazioni misfolding di proteine, tra cui shock termico 3,5,11,12. In secondo luogo, rimodellamento di cross-beta fibrille amiloidi da Hsp104 lievito permette di sfruttare una miriade di prioni (amiloidi infettive) come un serbatoio di benefici e ereditabile variazione fenotipica 13-22. Sorprendentemente, Hsp104 rimodella direttamente preamyloid oligomeri e fibrille amiloidi, compresi compresi quelli di proteine ​​prioniche il lievito Sup35 e Ure2 23-30. Questo amiloide-rimodellamento funzionalità è un aspetto specializzato di lievito Hsp104. La E. ortologo coli, ClpB, non riesce a oligomeri preamyloid rimodellare o fibrille amiloidi 26,31,32. Ortologhi Hsp104 si trovano in tutti i regni della vita tranne, stranamente, gli animali. Infatti, se le cellule animali possiedono un sistema enzimatico che le proteine ​​coppie disaggregazione di rinaturazione (piuttosto che degrado) rimane sconosciuto 33-35. Così, noi e altri hanno proposto che Hsp104 potrebbe essere sviluppato come agente terapeutico per varie malattie neurodegenerative legate alla misfolding di proteine ​​specifiche in oligomeri preamyloid tossici e fibrille amiloidi 4,7,23,36-38. Non ci sono trattamenti che riguardano direttamente la specie aggregate associati a queste malattie. Eppure, Hsp104 dissolve oligomeri tossici e fibrille amiloidi composto da alfa-sinucleina, che sono collegati con la malattia di Parkinson 23 così come le forme di PrP amiloide 39. Importante, Hsp104 riduce l&#39;aggregazione delle proteine ​​e migliora neurodegenerazione in modelli di roditori della malattia di Parkinson 23 e la malattia di Huntington 38. Idealmente, per ottimizzare la terapia e minimizzare gli effetti collaterali, Hsp104 sarebbe progettato e potenziato per rimodellare selettivamente aggregati specifici centrale per la patologia in questione 4,7. Tuttavia, la limitata comprensione strutturale e meccanicistica di come Hsp104 disaggrega ad un repertorio eterogeneo di strutture aggregate e proteine ​​non correlate frustra questi tentativi 30,40-42. Per comprendere la struttura e il meccanismo di Hsp104, è essenziale per lo studio della proteina pura e ricostituire la sua attività disaggregase con componenti minimi. Hsp104 è una proteina 102kDa con un pI di ~ 5.3, che hexamerizes in presenza di ADP e ATP, oppure a concentrazioni di proteine ​​in assenza di 43-46 nucleotidi. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la purificazione di molto attiva, stabile Hsp104 da E. coli. L&#39;utilizzo di E. coli permette semplificata produzione su larga scala e il nostro metodo può essere eseguita in modo rapido e affidabile per Hsp104 numerose varianti. Il nostro protocollo aumenta Hsp104 purezza e semplifica la sua 6 tag rimozione rispetto ad un metodo di purificazione precedente da E. coli 47. Inoltre, il nostro protocollo è più facile e conveniente di due protocolli più recenti 26,48.

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell&#39;ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di affinità<em&gt; E. coli</em&gt; Seguita da cromatografia a scambio anionico, His6-tag rimozione di proteasi TEV, e le dimensioni di esclusione cromatografia.

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  University of Pennsylvania. Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine ​​da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di affinità E. coli Seguita da cromatografia a scambio anionico, His6-tag rimozione di proteasi TEV, e le dimensioni di esclusione cromatografia.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Ricerca

Biologia

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificazione della M. magneticum Strain AMB-1 proteina Magnetosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generazione, purificazione e caratterizzazione di specie DISC1 Cell-invasive Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;