鄭研究室で電子顕微鏡の作業は、部分的にNIH（1R01GM082893、1R01GM098672、1S10RR026814 - 01とP50GM082250（A.フランケルまで））、および画期的な医学研究、機会の賞と新技術賞のUCSFのプログラムからの助成金からの補助金によってサポートされています。

1。カーボンコーティングのためのEMグリッドの準備<ol><li>蒸留水で大きなガラスのビーカーを埋める。 </li><li>水の表面にコロジオン（〜20μlの、酢酸アミルの2％、電子顕微鏡学、PA、米国）の一滴を削除するには、ガラスピペットを使用してください。コロジオンは水/空気の表面に薄いプラスチックの層を形成するために分散します。注：コロジオンの最初のドロップは、ほこりの粒子から水面をクリアするために使用されることがあります。最初のドロップからのフィルムの除去後、水の表面はほこりのは明らかです。 </li><li>光沢のある最密充填パターンで私達は通常50を配置〜100グリッド、、グリッド、水面に浮かぶプラスチック層の上にいずれかのテッドペラ社（アメリカ）、いずれかから購入した400または200メッシュギルダー銅グリッドEMを配置プラスチック層（図1A）に下向きにし、グリッドの側。注：400メッシュグリッドがルーチン負染色EMグリッドに対して優れている、200メッシュのグリッドでは、傾斜ペアの画像を収集するための優れているのに対し。 </li><li>おせっかいを焼くグリッドはプラスチック層上に配置されている面積よりわずかに大きい寸法を有する紙のCE。グリッド（図1B）の上に慎重に紙を置き、紙が（図1C）完全にウェットになるまで待ちます。注：異なる種類の用紙が異なる吸水率を持っている。紙があまりにも速く水を吸収しないことが重要です。それは速すぎて水を吸収し、しわの多くを行うため、例えば、定期的なフィルターペーパーは、この目的のために良くありません。しわの紙から作られた炭素膜は、このようにランダムな円錐形のチルト3D再構築用の傾斜ペアの画像を収集するためによくない平坦ではない、と。一つは、適切なものを見つけるために別々の論文をテストする必要があります。当研究室では、我々は地元の食料品店から購入したメモ帳から紙を使用している。時々新聞の紙も適していることが判明した。別のオプションは、日本語/中国語書道のために使用される相対的な厚さのライスペーパーを使用することです。 </li><li>急速に周囲にプラスチックフィルム上に切開を行い、に近い浸した紙。直後に、プラスチックフィルムと紙の間に挟まれたグリッドで紙をピックアップする鉗子のペアを使用してください。空気乾燥（図1D）のために上に向けてグリッドを使用してペトリ皿に紙を置き、注意を：それは、紙の空気乾燥させることが重要です。乾燥が速すぎて紙に多くのしわを生成します。 </li></ol> 2。カーボンコーティンググリッド<ol><li>我々の研究室で使用されるカーボンコーティングマシンはCressington 208C高真空ターボカーボンコーター（テッドペラ）です。私たちのシステムは、水晶振動子の発振周波数は、その表面上に堆積された膜の質量によって変化するという原理に基づいて、コーティングされた炭素膜の膜厚を測定するCressingtonの膜厚モニターを搭載しています。それはすべての実験室で頻繁に利用できないので、しかし、ここで記述されたプロトコルは、厚さのモニターを必要としません。 </li><li>カーボンコーティングmの鉛筆削り（テッドペラ）と負荷の炭素棒を使用して、炭素棒を研ぐachine（図2A）。 2本のロッド、鋭い先端とフラットエンドと他の高いものがお互いに配置されます。 </li><li>スライドガラスのフロスト面積の半分に真空グリースを塗り、グリッド（図2B）の隣に置きます。スライドガラスのフロスト面積の半分だけが真空グリースで覆われるべきである。注：真空グリースを持つ領域は、カーボンコーティング後の色は変更されません。真空グリースがある場合とない場合の隣接するエリア間のコントラストは、コーティングされたカーボンの厚さの推定を提供します。 </li><li>カーボンコーティングマシンのステージ上のグリッドに紙を置きます。グリッド（図2C）の隣にガラススライドを置きます。注：一つは、ガラススライドにプラスチックフィルムで被覆された最初の転送のグリッドは、コーティングする前に、ケースには多くのグリッドが紙から落ちることができる。 </li><li>真空チャンバーをポンプ、真空は10 -5 Torrのレベルに達するまで待ちます。注：低真空でコーティングがしばしばで、多くの大規模なカーボン粒子に、その結​​果、多くの火花を発生させるグリッド。 </li><li>非常にゆっくり電流を増加させる。カーボンロッドの鋭い先端は、最初の電流が増加するなど、白が赤となるでしょう。 直接肉眼で高輝度の先端を見てください 。コー​​ティングの起動時に電流の増加を停止します。スライドガラスは、灰色として濃い灰色に光を白から色を変更します。スライドの闇は、被覆された炭素膜の厚さを相関させる。所望の厚さが達成された時にコーティングを停止するには、現在の機能をオフにする（図2D）。注：1）繰り返される炭素のコーティングプロセスの後、ガラスのベルジャーの内側からコーティングされた炭素を暗く、その色できた。これは、コーティングされた炭素膜は、それが実際よりも太く表示されるようになります。 2）1つのシャープカーボンロッドは、いくつかのコーティングに使用することができます。先端の鋭さは、徐々に各コーティングの後に削減されます。最大電流は、炭素棒のシャープネスに影響されます。小さい直径を持つ新鮮な尖った棒は低い相対が必要です。炭素を蒸発させるために、現在の。後でコーティングは若干高い電流が必要な場合があります。 </li><li>真空チャンバーを大気開放し、後で使用するためにコーティングされたグリッドを削除します。 注1。カーボンの厚さを制御するのより正確な方法は、膜厚モニターを使用することです。または1つの質的にモニターで測定された正確な厚さに対して色を調整することができます。このテクニックのための有用な炭素の厚さは3〜7 nmである。 </li></ol>これは通常、炭素コーティングされたグリッド、〜準備あたり100グリッドの大規模な量を準備する簡便な方法です。グリッドは、通常、ネガティブ染色画像の品質に影響しない薄いプラスチックの層を、含まれています。しかし、この方法で調製されたグリッドはcryoEMには適していません。プラスチックのこの層は、数時間のためにクロロホルムにグ​​リッドを浸すことによって除去することができます。 3。 EMを染色陰性のためのウラニルのギ酸塩溶液（0.75％）の準備。詳細なプロトコルであった以前に5を説明し<ol><li>小さなビーカーにウラニルギの37.5mgを秤量。 </li><li>沸騰した水5 mlを加え、暗所で5分間攪拌する。 </li><li> 10μlの5MのNaOHを追加、5分間攪拌を続行。 </li><li>シリンジフィルター（Fisherbrand、13ミリメートルシリンジフィルター、0.2μmの、ナイロン、非滅菌、カタログ番号09-720-5）を使用してソリューションをフィルタリングし、アルミ箔で覆われた8ミリリットルファルコンチューブにろ液を保存する。 （注）。ウラニルギ粉末を電子顕微鏡学（ハットフィールド、ペンシルバニア州）、カタログ番号22451から購入することができます。ウラニルのギ酸塩溶液は光に敏感であり、アルミ箔でファルコンチューブを覆うことにより、例えば、直射光から維持する必要があります。新たに調製した溶液は淡黄色色（図3A）があります。それが沈殿開始する前に染色液を1週間から2週間ベンチ上に保存することができます。ウラニルギは、pH〜4と酸性です。 NaOHを追加すると、pHが増加しますが、急激に追加または過剰に沈殿物への汚れを引き起こす可能性があります。コントラストを生成するだけでなく、ウラニルのギは、タンパク質サンプルを修正しています。固定率は非常に急速であるため、低pHは、通常、全体的なタンパク質のコンフォメーションまたはタンパク質複合体形成7を影響しません。 </li></ol> 4。負染色EMグリッドを調製するためのプロトコル。このプロトコルは、これまで5で詳しく説明され<ol><li> PELCO easiGlow GlowDischargeシステム（テッドペラ社、米国）を使用してグロー放電の炭素コーティングされたグリッド、。使用される電流は15mAとグリッドです30秒。 注記のために放電グローです。グロー放電グリッドは、グローの放電後すぐに使用する必要があります。私たちはしばしば、グロー放電の後2時間以内にグリッドを使用してください。 </li><li>場所を蒸留水で220μlの滴とパラフィルムの一部でウラニルのギ酸塩溶液の二つ25μlの滴（図3B）。 </li><li>車で逆力抗キャピラリー鉗子を使用してグロー放電グリッドを保​​持するボンでコーティングされた面を上向きに。注：これは、抗キャピラリー鉗子を使用する必要がある。そうでない場合は、液体試料は鉗子との間の毛管力によって離れてグリッドから吸い込まれる。 </li><li>グロー放電グリッドに2μlのタンパク質試料を塗布し、30秒待つ。注：待ち時間とグロー放電の長さがグリッドに吸着した蛋白質の濃度に影響を与える。非常に希釈した試料では、より長い吸着時間が必要です。しかし、長引く吸着は、水の蒸気からの緩衝液濃度を変更することができます。グリッド内の適切な粒度分布を実現するためには多少試行錯誤のアプローチが必要です。 </li><li>ろ紙を使用してサンプルをオフに汚点。 </li><li>水滴にグリッドの表面をタッチし、ろ紙で水をオフに汚点。水の2番目のドロップで繰り返します。 </li><li>汚れ簡単にの最初のドロップにグリッドの表面に触れます。ろ紙で染色液をオフに汚点。 </li><li> 20秒間染色の番目のドロップにグリッドの表面に触れます。ブロットOろ紙とffの染色液。 </li><li>真空を使用してグリッドを乾かします。注：一つもベンチ上や空気乾燥の化学フードでグリッドを残すことができます。真空乾燥の利点は1つがすぐにEMでグリッドを観察できることです。速乾性に生成される可能性のあるアーティファクトは、染色ムラです。 </li></ol> 5。透過型電子顕微鏡<ol><li>このデモで使用されている顕微鏡はガタン4K X 4K CCDカメラを搭載したTecnai T12（FEI社）です。 </li><li>簡潔にサンプルを挿入する前に、顕微鏡のアライメントをチェックしてください。注：これは、EMセッションごとに一度必要とされる。モデルの顕微鏡では、近くのアライメントは、以前に保存することができます。このようなアライメントファイルをロードすると、近くの状態に顕微鏡の配置を復元する必要があります。 </li><li>単一のチルト標準試料ホルダにEMグリッドをロードします。 </li><li> T12のCompuStageにホルダーを挿入します。完了するまでポンピングサイクルを待ちます。 </li><li>列にホルダーを挿入します。&lt;/ LI&gt; <li>試料をフォーカスし、必要なデフォーカス、通常- 1.5umを設定します。注：フォーカシングは手動で最小コントラスト法を使用してフォーカスやライブ映像をキャプチャし、ライブのフーリエパワースペクトルを計算するためにCCDカメラを使用するか達成することができます。 </li><li> CCDカメラを使用して画像を記録する。 </li><li>ネガティブ染色タンパク質サンプルの画像では、タンパク質はしばしば白のコントラスト、暗い背景に白文字密度と見られている。同じグリッドのさまざまな分野でのタンパク質の濃度は通常、非常に類似している間、1つは同じグリッドのさまざまな分野で汚れの異なるレベルを観察することに注意してください。いくつかの他の地域では完璧には汚れているのに対し、時々の分野では、不均一な染色あるいは陽性染色を（蛋白質は、明るい背景に暗い表示される）可能性があります。それは、しばしばイメージングのための良いエリアを見つけるためにグリッドを検索する必要があります。 </li></ol> 6。代表的な結果マイナスのSTAの典型的な良いイメージの例inedサンプル、馬脾臓フェリチン（図4A）、ファブ（図4B）、プロテアソーム（図4C）とヌクレオソーム（図4D）古細菌の20Sは、示されている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> 図1。 EMを染色陰性のための炭素コーティングされたグリッドの準備。）EMグリッドコロジオン膜の表面上に閉じたパッキングパターンで一つずつ配置する。 B）グリッドの面積より少し大きめの紙を置く。紙が完全に濡れるまでC）待ちます。 D）空気乾燥のためのグリッドと一緒に紙をピックアップ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> 図2。 。ポイントの先端に尖ったoneロッド（左）と、塗工装置で行われる二つの炭素棒： カーボンでコーティングEMグリッド ） は、炭素の蒸発器をセットアップします。他のロッドは、（右上）平らな面を持ち、反対の内の1つの点の先端と接触IDE。 B）育んでスライドガラスの片面に真空グリースの少量を置きます。黒い枠内の領域は真空グリースを持っています。 C）コーティング用のグリッドを設定します。ガラスのスライドは、位置に用紙を保持するために使用されます。矢印は、真空グリースで領域を指します。 D）コーティングした後、対象となる真空グリースとスライドの色は、色を変更しません。コントラストは、コーティングされたカーボンの厚さを示している。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> 図3。ネガティブ染色の手順を示す。）新たに調製した（左）ウラニルのギ酸塩溶液は、沈殿物の符号なしに透過的です。 1〜2週間後、チューブの底の底に蓄積を開始沈殿。 B）蒸留水とパラフィルムの部分にウラニルのギ酸塩溶液2滴2滴（〜25μlの）を配置します。炭素側でグロー放電炭素でコーティングされたEMグリッドを保​​持するために抗キャピラリーピンセットを使用して、アップ。サンプルのドロップ（〜2μlのは）、グリッドに配置されます。 C）30秒間待機した後、ろ紙で解決策を汚点。 D）水の最初のドロップでグリッドのサンプルの面には手を触れないようにグリッドを反転します。染色のプロセスを完了するには、ステップCとDを繰り返します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> 図4。ネガティブ染色タンパク質サンプルのEM画像の例。）馬脾臓フェリチン、B）抗原の結合（ファブ）、Cの断片）プロテアソームとD古細菌の20S）は、ヌクレオソーム。すべての画像は同じ倍率で記録した。スケールバーは20nmのです。

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	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ネガティブ染色EMは、このようなランダムな円錐形の傾斜と同じ領域から試料から一60℃に傾けたといずれかで画像のペアを収集する必要がある8形式のメソッドを、使用して、精製タンパク質サンプルの立体構造を、研究するために使用できる強力なツールです。しかし、高分子複合体の3次元再構成を計算するために、untilted。さらに、ネガティブ染色EMは異なるコンフォメーション10で、または単に均質性および/ ​​またはそのためのタンパク質サンプルを精製の ​​不均一性を可視化するためのタンパク質複合体を可視化する、そのような膜タンパク質9の2次元（2D）の結晶のためのスクリーニングなど、他の多くのアプリケーションを、持つことができますタンパク質精製の手順を改善するためにフィードバックを提供する、などこれは、生化学者のための強力なアッセイすることができます。この記事では、我々は電子顕微鏡でネガティブ染色タンパク質サンプルの画像を収集するためにカーボンコートしたグリッドを準備するに至るまでのプロトコルを発表した。ここに示すように、手順はかなり簡単に従うことが容易です。ランダムな円錐形の傾斜法で観察されているサンプルの3D再構成を計算しようとする場合、それは傾斜ペア画像を取得する必要があります。しかし、単粒子解析を行うことが目的であれば、複数のuntiltedの画像で十分です。どちらの場合で、さらに画像処理が必要となり、これはこのビデオの記事の範囲を超えています。 任意のメソッドと同様に、プロトコルのバリエーションがあります。ウラニルギは、ほとんどの場合否定的な染色試薬として非常にうまく機能します。酢酸ウラニルは別の、一般的に使用される負の染色試薬です。それは、しかしより大きな粒径と、多くの場合、ウラニルのギより低いコントラストで、ウラニルギとして非常に似た働きをします。酢酸ウラニルを使用する利点は、ソリューションがウラニルギより長く続くということです。一つは、一人一人または二週間新鮮な溶液を調製する必要はありません。ウラニルギと酢酸の両方が酸性である。明白な懸念は低pHは、研究されているタンパク質サンプルの変化を誘発することができます。両方の染色ソリューションはまた、タンパク質の固定剤として機能する。以前の研究では、両方の修正タンパク質サンプルを迅速7が示されている。この急速な固定は、低pHが重要になります。染色の過程で、タンパク質試料は、低pHがどんな変化を誘導する前に固定になります。それにもかかわらず、このようなモリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸などの他の負染色試薬は、低いpHが懸念7のときのサンプルを染色するためのより良い結果をもたらす可能性があります。モリブデン酸アンモニウムとリンタングステン酸の両方がほぼ中性のpHを有するが、これらの汚れによって生成されたタンパク質サンプルのコントラストは、通常ウラニルギに劣っている。

<table border="1"><tbody><tr><td> の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コロジオン</td><td>電子顕微鏡学、PA、アメリカ合衆国</td><td> 12620〜30 </td><td>酢酸アミルの30ミリリットル、2％ </td></tr><tr><td>ギルダー銅グリッド</td><td>テッドペラ社、米国</td><td> G400/G200 </td><td> 200分の400メッシュ</td></tr><tr><td> Cressington 208C高真空ターボカーボンコーター</td><td>テッドペラ社、米国</td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td>ダブルは、カーボンロッドを指摘</td><td>テッドペラ社、米国</td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td>ウラニルのギ</td><td>電子顕微鏡学、PA、アメリカ合衆国</td><td> 16984-59-1 </td><td>純度99.9％ </td></tr><tr><td> PELCO easiGlowのGlowDischargeシステム</td><td> TEDペラ社、米国</td><td> 91000 </td><td>地元の薬局で購入</td></tr><tr><td>ワットマン＃1フィルター紙</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 09 - 805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

否定的なステンドグラスや凍結水和生体試料の両方の単粒子の電子顕微鏡（EM）は、構造生物学1の多目的なツールとなっています。近年では、この方法はタンパク質と高分子複合体2、3の構造の研究に大きな成功を収めています。凍結水和蛋白質のサンプルは硝子氷4の薄層に埋め込 ​​まれている電子低温顕微鏡法（cryoEM）、、ネガティブ染色と比較してタンパク質サンプルを高めるために乾燥重金属塩の薄層に埋め込 ​​まれている単純なサンプル調製法です試料のコントラスト5。ネガティブ染色EMの拡張されたコントラストは、比較的小さな生物学的サンプルの検査が可能になります。タンパク質やタンパク質複合体6を精製の​​3次元（3D）構造を決定することに加えて、この方法ははるかに広い目的のために使用することができます。例えば、負のEMが容易に精製された視覚化するために使用することができる染色タンパク質サンプル、そのような同質性/サンプルの不均一性、蛋白質の複合体または大規模なアセンブリの形成、または単にタンパク質調製物の品質を評価するなどの情報を取得する。 このビデオの記事では、我々は120kVの加速電圧で動作する電子顕微鏡でネガティブ染色サンプルの画像を取得するためにEMを染色陰性のための炭素コーティングされたグリッドを準備するから、ネガティブ染色タンパク質試料を観察するためにEMを使用するための完全なプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、日常的に我々の研究室で使用されており、簡単に初心者ユーザを続けることができます。

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳細なプロトコールを提示する。初心者ユーザーは、簡単にこれらのプロトコルに従うことができますし、それらのタンパク質サンプルを評価するため、他の生化学的アッセイに加えて、ルーチン分析としてEMを染色陰性活用する。

ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K ビュー.  University of California San Francisco. 負染色電子顕微鏡（EM）で視覚化するタンパク質サンプルは、ポピュラーな構造解析の方法となっている。それは、タンパク質製剤の品質の定性試験のためにもそのような研究されている分子の三次元再構成を計算すると、定量的な構造解析に有用である、と。この記事では、EMグリッドを準備する試料を染色し、電子顕微鏡で試料を可視化するための詳?...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

生物工学

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...