この研究の全体的な目標は、ヒトIPS細胞を神経系統に培養し、分化するための自動手順と、それらの自動イメージングを実装する方法を示す方法です。標準化された自動化されたプロシージャは高い平明な再現性を保障する間低い実験的な変化を可能にする。さらに、システムは新しいプロトコルの開発のために適応することができる。
手順を実証するのは、ヨアヒム・タガーとエリザンジェラ・ブレッサン、私たちの研究室からのポストドキュメントです。自動化システムのグラフィック・ユーザー・インターフェースで、「リソース・インストゥルメント・プロセス・ビュー」をクリックし、リソース・インストゥルメント・プロセスを選択します。[計測器の実行] プロセスをクリックし、実行 HEPA フードとリロード プロセスを実行します。
ロードするリソースを選択し、ドアを開けて、ポップアップ画像で示される適切な位置に細胞培養プレートと使い捨てのヒントをロードします。その後、閉じる前に70%エタノールでドアを除染し、除染プロセスを実行します。システムは30分間紫外線照射によって殺菌される。
プレートに培養液または解離試薬をロードするには、実行HEPAフードステップを実行し、液体ハンドリングステーションのドアを開けます。70%エタノールで除染した後、デッキの貯蔵所を割り当てられた位置に置き、それらを取り外します。液体ハンドリングステーションのドアを閉め、InitHepaHoodリソース機器プロセスを実行してHEPAフードの電源を切ります。
自動化されたカルチャ方式を実行するには、グラフィック ユーザー インターフェイスのカレンダー ビューで、[プロセス ステップの追加] をクリックし、実験で使用するセル行を選択します。ウィザードを使用してプロジェクトを選択し、使用するバッチをマークします。右向きの矢印をクリックし、ウィザードの次のページに移動して、実行するプロセスステップを選択します。
ウィザードの最後のページで、実験をスケジュールし、メソッドの実行に必要な適切なパラメータ詳細変数を設定します。次に、[OK] をクリックします。ヒトIPS細胞懸濁液を用いて50ミリリットルのチューブをロードした後、棚に細胞を受け入れるための培養プレートをロードし、チューブ法からプレートの播種を実行する。ブライトフィールドイメージングサイトメーターの細胞をカウントするには、デッキにセルサスペンションを備えた384ウェルカウントプレートを自動的に準備し、ロボットアームを使用してデッキからブライトフィールドイメージングサイトメーターに384ウェルカウントプレートを転送します。
カウント後、システムはプレートを元の位置に戻し、コーティングされた培養またはアッセイプレートを棚からピペットデッキに移します。システムは、プレートに適したユーザー定義の数とボリュームでセルをシードし、ピペット加工によって混合します。播種後、プレートは、二酸化炭素インキュベーターに移される前に、細胞分布のために毎分500回転で10秒間オンデッキシェーカーに移動されます。
自動合流を評価するには、コンフルエンスのチェック方法を実行し、少なくとも1つの培養プレートとアッセイプレートを含むバッチを選択します。パラメータ詳細セクションで、撮像解析設定でiPSCf_2020を入力します。システムは、インキュベーターからブライトフィールドイメージングサイトメーターに最初のプレートを転送し、細胞合流を画像化します。
細胞培養またはアッセイプレート培地を変更するには、培養プレートの媒体交換方法を実行し、培養プレートのみを含むバッチを選択する。システムはデッキに版を移し、上清の吸引を可能にするために版を傾ける。上清は、廃棄物回収モジュールに廃棄され、先端を廃棄し、新鮮な媒体の12ミリリットルは、各プレートに追加されます。
システムは、プレートを再蓋し、細胞培養インキュベーターにプレートを返します。あるいは、アッセイプレートの媒体を変えるために、アッセイプレート法の媒体交換を行う。細胞をサブ栽培するには、接着細胞のサブ栽培方法を実行し、サブ栽培を必要とする培養プレートを含むバッチを選択する。
培地を廃棄した後、システムは細胞に0.5ミリモルEDTAの8ミリリットルを加える前に、1皿あたり8ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄する。チルトオプション付きデッキで8分後、EDTAはプレートあたり12ミリリットルの新鮮な媒体に置き換えられます。システムは、50〜80ミクロンの塊にコロニーを分割するためにピペットの5サイクルで細胞を三tutuatsする前に、コロニーを取り除くために1分間2,000回転でプレートを揺らします。
細胞は、1対7の分割比でそれらを播種する前に、デッキ上の50ミリリットルチューブに移されます。自動高含有量、高スループットのセルイメージングの場合は、イメージング方法を実行し、少なくとも1つのアッセイプレートと培養プレートを含むバッチを選択します。システムは、次に、アッセイプレートを自動共焦点顕微鏡に転送してイメージングします。
必要なプロセスステップを実行している間は、正しいバッチ ID とプレート ID を選択してください。hiPSC培養は、成長のために毎日監視され、ブライトフィールドイメージングサイトメーターにおける合流率を分析する必要があります。通過および手動または自動化されたシステム培養の後、細胞は典型的な幹細胞および多能性マーカー発現を示す。
自動培養系で分化されたニューロンは、手動で栽培されたニューロンと同様の形態およびニューロンネットワーク組織を示す。6日間の分化後、自動的に分化した皮質ニューロンは、ニューロン固有クラスIIIβ-チューブリンおよび上皮層マーカー発現に陽性である。8日後、細胞はまた、微小管関連タンパク質2、神経細胞接着分子、およびシナプシンI、ならびに皮質ニューロンマーカーを発現した。
これらのマーカーの発現が非常に低いか、または全くhiPSCで観察されない。このシステムはまた、手動介入なしに11日間にわたって分化の神経突起長を測定することを可能にする生細胞の自動神経突起伸長アッセイを確立するために使用することができる。自動化された培養システムを使用して65日間の培養期間にわたって培地の変化を行うことは、期待される細胞組織および形態を有する中脳ドーパミン作動性ニューロンへのhiPSC分化を促進する。
神経突起の成長に加えて、神経変性の研究に関連する他の自動表現型アッセイ、例えば、TDP-43転座RNA病巣およびα-シヌクレインフィブリル取り込み、この高スループット、高コンテンツフォーマットを用いて探索することができる。
