この記事の出版物は、テネシー大学の研究局からの助成金によって支えられて。著者らは、これらの手順を絞り込むには働いている学生や研究者の前世代に感謝。研究は全米科学財団（NSF - 0851113、NSF - 0825405とNSF - 0550485）からの補助金によって支えられている。

1。 &quot;ウイルスフリー&quot;水（ヴィルヘルム＆Poorvin 2001）を生成するために海水の限外ろ過<ol><li>海水/ lakewaterの約20Lを無菌的に可能な限り収集されます。 </li><li>水はシリアル142 - mm径のポリカーボネートを通じて地域社会の分析のために-20℃で保管することができます0.8μmのフィルタをフィルタ処理されている。より大きな孔径のフィルターは、非常に生産的なシステムのためのこのステップの前に使用することができます。 </li><li> 30kDaのカットオフスパイラルカートリッジはすべてのウイルスを排除するために使用されるアミコンM12システム（ミリポア）、さらに小型のRNAウイルスから限外濾過水を得るために。 </li><li>サンプルは、背圧の〜15から16 kPaで〜25％の速度で処理し、濃縮されています。 </li><li>水の〜500mLの残りのサンプルでは、​​ウイルスのない水の残りの19.5 Lのウイルス産生のアッセイに使用される一方、濃縮ウイルスのコミュニティを（これは他の実験のために保存することができる）が含まれます。 </li><li>使用のそれぞれの一日を過ごした後、アミコンM12システムは、フィルターカートリッジの膜への損傷を防ぐために洗浄する必要があります。 </li><li>もし海水を使用している場合は、30〜45分のための0.1N NaOH溶液で洗浄した後、Milli - Q水の少なくとも6Lで膜をすすいでください。 </li><li>再びMilli - Q水の少なくとも6Lでカートリッジをすすいでください。 </li><li> M12システムの使用を終了するときに、スパイラルのカートリッジは4で0.05MH 3 PO 4水溶液℃で保存してください。 </li></ol> 2。ウイルス産生のためのウイルスの削減手法（ヴィルヘルムら、2002） <ol><li>その上に置かれた0.2μmの公称孔径の低タンパク質結合フィルター（例えば、デュラポア）で取得し、sterifilterユニットに配置され、最大ホストとウイルスの両方で海水/ lakewaterサンプルの500mlに。 </li><li>継続的にフィルターに集中するから、細菌細胞を抑制するために無菌トランスファーピペットを使用してサンプルを再懸濁しながら、サンプルを穏やかに&lt;200 mmHgの時に圧力をかけて真空されています。 </li><li>ゆっくりと限外濾過の三巻が大幅に試料中の遊離ウイルスの数を減らすために細菌懸濁液に添加されています。 </li><li>細菌の割合は、ウイルスフリーの水で500mLに戻って希釈し、3つに分割されている150mLのそれぞれの複製と透明な250ミリリットルポリカーボネートボトルに配置されます。 </li></ol> 3。ウイルス産生のためのタンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF）メソッド（Weinbauer ら、2002、ウィンゲットら、2005） TFFは、ウイルス還元法に代わるアプローチを表します。 <ol><li>上記のような天然試料の約500mLを集めています。 </li><li>このサンプルは、0.2μmの公称孔径タンジェンシャルフローろ過システムを用いて濃縮される。 </li><li>細菌の割合が約10〜15 mLに低下すると、限外濾過、ウイルスフリー水を添加し、上記のように配布されています。 </li><li>複製ボトルは、環境槽を用いてその場の条件でインキュベートする。 <ol><li>光レベルは、光強度を減少させるためにネットスクリーニングと青がかったアクリルまたは透明なアクリルを使用して表面状態に変更されます。 </li><li>周囲の表面温度は、しばしば流れる海水デッキインキュベーターを使用することによって得られる。 </li></ol></li><li>細菌とウイルスの資源量推定値のサンプルはcryovialsに追加さ2.0〜2.5パーセント滅菌グルタルアルデヒドの最終濃度で、時間0で撮影されています。これらのサンプルは、直ちに液体窒素で凍結させ、処理されるまで凍結されたフラッシュされています。 <ol><li>液体窒素が使用できない場合は、顕微鏡のスライドは、（次の手順を参照）を調製し、直ちに処理されることがあります。 </li></ol></li><li>サブサンプルは、上記の方法で少なくとも10時間毎に2.5時間を集めています。 <ol><li>この時点で水は定量的PCR解析のために収集されることがあります。最大サンプルを5 mLまで液体窒素中で即座にフラッシュの凍結と無固定剤をクライオバイアルに添加することができる。 </li></ol></li></ol> 4。ウイルスの生産顕微鏡（ノーブル＆ファーマン1998年、温家宝ら 2004） <ol><li> 0.02μmの顕微鏡用にフィルタリングされる凍結試料を氷上で融解してください。 </li><li>滅菌水で原液を1:10に希釈してSYBR Greenのストック溶液を調製。次に、ストック溶液から、滅菌水39 mLに原液の1mlを加えることによって、作業溶液を調製。 50％グリセロール、50％のリン酸塩は生理食塩水をバッファ（PBS、0.05 MのNa 2 HPO 4、0.85％のNaCl、pH7.5）およびp -フェニレンジアミンの新鮮な2.5％の原液は、開始前に準備する必要があります。 4に50％glycerol/50％PBS溶液を保持° CとP - phenylenediam-20伊根の株式△初任まで、暗所で。右の退色防止ソリューションとして使用される最終濃度0.1％を50％glycerol/50％PBSにp -フェニレンジアミンを追加フィルタリングの前に。 </li><li> 0.45μmのMicronStep、セルロース系バッキングフィルターの上に0.02μmのAnodiscフィルター25mmを置きます。完全に乾くまでに20のpKaでAnodiscと真空の上部に固定されたサンプル850μLを加える。場所100滅菌シャーレにSYBRグリーンワーキング溶液μLと、上でも、真空で、慎重にSYBRグリーン上でフィルタ塔と場所からAnodiscを削除します。 20分間室温で暗所でサンプルをインキュベートする。慎重にSYBR Green液からフィルタを削除して、すべての残留色素を除去するキムワイプとフィルターの後ろを放出する。必要に応じて、タワーにフィルターを戻し、余分な汚れを洗い流しますするフィルタを介して0.02μmのフィルタ処理された水または無菌のメディアの800μLまで渡す。 </li><li>顕微鏡のスライドに退色防止ソリューションの小滴を追加し、上にカバースリップを配置。カバーガラスを外し、退色防止ソリューションによる湿式顕微鏡のスライドに乾燥フィルタを追加します。再び、カバーガラスに退色少量の溶液を加えると徐々に形成する可能性のある気泡を取り除くために確認しながら、フィルターの上に置きます。 </li><li>必要になるまで、すぐに（これらはフェージングと低下ウイルスのカウントを防ぐために、数ヶ月以内に使用されるべきである）-20℃でスライドを凍結する</li><li>ウイルスは、広い青いフィルターセット（λ 例 = 450〜490 nmの、λ エム λにおける抑制フィルタ付き= 510 nmの= 510 nm）を（我々の場合ライカDMRXA顕微鏡）蛍光顕微鏡を使用して列挙されます。各フィルタは、フィルタ膜を通過するウイルスを均等に各フィールドのグリッドから合計ウイルスを定量化することを確認し、カウントビューの少なくとも20個のフィールドを持つことになります。 </li><li>三つの独立からのウイルスの再発の平均速度は、計算されると標準偏差は、生産率から決定される複製。 </li></ol> 5。代表的な結果研究者によって収集された生データは、ウイルスの存在量の再発率を生成するための最小限の数学的処理が必要になります。この研究から生じる主要なデータセットには、インキュベーションから二次検体中のウイルスの存在量の再発率である。これらの結果は、試料の各々のウイルスの存在量対時間の独立した回帰を形成する。各サンプルについて、個々のインキュベーションでは、その研究者が同様に変動の推定値（例えば、標準偏差）として速度を計算することができる3つの繰り返し、インキュベーションを行うことにより、一つの治療、（図1を参照。）として機能このプロセスの一つの注意点は、ウイルスの存在量不変の減少は、ウイルスの負担を運んでいるサンプルで宿主細胞の減少につながるということです。この損失を相殺するために、ソース（フィルタ処理されていない海水や湖沼の水）とT = 0インキュベーションのサンプルの両方からの細菌の存在量の列挙が必要です。この情報は、失われた細胞の割合を考慮するために使用することができます。ウイルスの存在量を減少させるプロセスは微生物コミュニティのあらゆるメンバーのためにまたはに対して選択的ではない、この因子がその後、ウイルスのその場の生産率の推定に使用することができると仮定。 <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。落射蛍光顕微鏡を用いた原位置条件下で少なくとも10時間のインキュベーションオーバーウイルス様粒子の生産。サンプルは2008年9月にニュージーランド沖の咲く植物プランクトン中に収集された。 <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。ウイルス産生をアッセイするためのワークフロープロセスの模式図。プロセスは、ウイルスフリー水を生成するために、サンプル水のろ過から始まります。これは、限外ろ過システムを使用して完了します。微生物群集が（感染および非感染細胞の混合物を含有する）保たれる間、パラレル水サンプルに同じサイトから収集され、無料のウイルスがフィルターを通過。このコミュニティは、ウイルスフリーの水に再懸濁し、 その場の状況の下でインキュベートする。ウイルスの再発率は、ウイルス産生の速度を決定するために、次の10時間監視されています。

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	<li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean.">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li><li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria:+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter.">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li><li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria.">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li><li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems.">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li><li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. 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G., Winter, C., H&amp;ouml, f. l. e., G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities.">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li><li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy.">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li><li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. 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利害の衝突は宣言されません。

ウイルスは、海洋微生物群集にどのように影響するかを理解する上で重要な部品とは、ウイルス粒子が生成されるレートを決定することです。 （ヴィルヘルムら、1998）水生システムに迅速に存在量はほとんどのシステムでは（多かれ少なかれ）静的であることを考えると（ヴィルヘルム＆サトル1999、Weinbauer 2004）、そしてそのウイルスは、非感染性の除去またはレンダリングされ、その後、生産率は、でなければならない相対的な急速な失われた粒子を交換する。 死亡率のウイルスは微生物群集の原因と推定することは、ウイルスが細胞を（&quot;バーストサイズ&quot;）溶解するたびに、生成される多くのウイルスの知識が必要です。天然試料中のウイルスのバーストサイズは​​大きく異なる可能性があります。バーストサイズは​​、透過型電子顕微鏡（例えば、Weinbauer＆Peduzzi 1994）によって直接決定されるが、これは必ずしも現実的ではない与えられた実験室の能力を超えて多くの場合、またはすることができます。それらは経験的に決定することができない状況では、溶解イベントあたり24ウイルスの文献値は、海洋システムや淡水系（パラダほか 2006）のための34のために使用することができます。ウイルス産生の割合がこの数値によって分割されている場合、結果は毎日、ウイルスによって破壊された体積あたりの細胞の豊富さです。値を溶解微生物は、問題のシステムのためのウイルスによる死亡率をもたらす細菌の存在量の立っている株式によって分けることができます。数パーセントからほぼ全人口に既存の推計範囲及び当該のシステムではしばしば他の要因に依存しています（ヴィルヘルム＆マッテソン2008）。総死亡率の割合を決定するためにこの数は、多くの場合、両者（細胞の50％が再現するに行くことを前提で仕事をし、細胞の50％が失われ、Weinbauer 2004）によって乗算されます。 となっている栄養素や微量元素の生物学的利用能（例えば、N、P、Fe）の一次生産の速度を制限し、そのような炭素フラックスとして、水生システムを通じて、そしてこの過程でウイルス駆動型微生物の死亡率の役割を理解できることを考える海洋地球化学への関心の。いくつかの推定値は、現在（2009年、2008年、ヒギンズらロウら ）ウイルスが日常的に水の列に戻って養分の有意な濃度を放出示唆それが存在し、これらの要素が急速に微生物群集によって同化されること（Poorvin らら2004年、ミら、2005）。環境への養分フラックスの割合は、栄養素ごとのセル（&quot;クォータ&quot;と表記）の量によって破壊された細胞の数を乗じて求めることができます。この情報は、微生物食物網は、水系全体でどのように機能するかについての我々の理解に不可欠なコンポーネントを提供することができます。 継続的な開発：現在の努力の研究グループの一連では、コミュニティ内の特定のウイルスを列挙すると、次のような、ウイルスの活動によって影響を受けているどのように特定の微生物を決定するために上記の戦略を適応させる伴う。これを行うには、研究者は全体のウイルスのコミュニティの推定値に並行して特定のウイルスのグループや家族の存在量を推定する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）を使用してください。結果は、直接、特定のプランクトンのグループのためのウイルスの死亡率、栄養売上高などの推定値を提供するために適用されます。この強力な新しいアプローチは、今後数年間で研究者が実験室のシステムの制約を超えて特定のウイルス - 宿主の社会の相互作用を定量化するためにウイルスの生態学に関連するプロセスや、初めて、にはるかに深く掘ることができます。

<table><tbody><tr><td>2.5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>Stock for Antifade</td></tr><tr><td>Amicon Proflux M12 system</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Any ultrafiltration device may be used for this step</td></tr><tr><td>SYBR Green I nucleic acid gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>Helicon S10 30kDa Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>Pelicon XL filters 0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>GE 0.2 &amp;mu;m PCTE membrane filters (47mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>Other TFF systems may be used for this step</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m Micronstep, Cellulosic, white plain filters (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>GE Whatman 0.02 &amp;mu;m Anodisc filters (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA microscope</td><td></td><td></td><td>Any epifluorescence microscope with a blue filter set may be used</td></tr><tr><td>20L polycarbonate carboys</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0.05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyde </td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>Any cryovials may be used</td></tr><tr><td>Corning 5 mL Cryovials-External Thread polypropylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>Any cryovials may be used</td></tr><tr><td> 85% H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>Spiral Membrane storage</td></tr><tr><td>NaOH pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>M12 cleaning</td></tr><tr><td>Graduated Cylinders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopore 0.8-&amp;mu;m pore-size membrane filter (142mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Stainless Steel Pressure Filter Holder (142mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

estimating virus production rates in aquatic systems

ウイルスは、海洋および淡水システムの広範な成分であり、微生物の死亡率の重要な薬剤であることが知られている。我々はその後、微生物群集の構造と機能の優れたモデルを開発するだけでなく、ウイルスが水生生物地球化学サイクルを変更する仕組みについての我々の理解を進めることができるように、このプロセスの定量的な推定を開発することが重要です。ウイルスの低減技術は、研究者は、ウイルス粒子が風土病微生物群集から放出される速度を見積もることができます。微生物群集が付近の周囲の濃度に維持しながら簡単に言えば、フリー（細胞外）ウイルスの存在量は、サンプルに低減されます。微生物群集は、その後、フリーのウイルスや落射蛍光顕微鏡または、特定のウイルスの場合で、定量的で定量化することができるウイルスサンプルの再発（コミュニティのすでに感染しているメンバーの溶解を通じて）レートの存在下でインキュベートするPCR。これらのレートは、その後、ウイル​​ス媒介細胞溶解に起因する微生物の死亡率を推定するために使用することができます。

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

海洋および淡水系におけるウイルスの離職率は低下し、再発の手法によって推定することができる。データは、研究者は、水系におけるウイルス媒介微生物の死亡率を推測することができます。

水系でのウイルス産生率を予測

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.6K ビュー.  University of Tennessee. 海洋および淡水系におけるウイルスの離職率は低下し、再発の手法によって推定することができる。データは、研究者は、水系におけるウイルス媒介微生物の死亡率を推測することができます。

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A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

環境学

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

特定のヒトと動物のウイルスを用いた微生物ソースのトラッキングのための費用対効果の高い方法

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

免疫・感染学

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The recovery of microbial fractions, including viruses, bacteria, and microeukaryotes from wastewater and environmental water samples&#160;is one of the challenging steps in these approaches. In this study, we focused on the recovery efficiency of sequential ultrafiltration and skimmed milk flocculation (SMF) methods using Armored RNA as a test virus, which is also used as a control by some other studies. Prefiltration with 0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m membrane disc filters were applied to eliminate solid particles before ultrafiltration to prevent the clogging of ultrafiltration devices. Test samples, processed with the sequential ultrafiltration method, were centrifuged at two different speeds. An increased speed resulted in lower recovery and positivity rates of Armored RNA.&#160;On the other hand, SMF resulted in relatively consistent recovery and positivity rates of Armored RNA. Additional tests conducted with environmental water samples demonstrated the utility of SMF to concentrate other microbial fractions. The partitioning of viruses into solid particles might have an impact on the overall recovery rates, considering the prefiltration step applied before the ultrafiltration of wastewater samples. SMF with prefiltration performed better when applied to environmental water samples&#160;due to lower solid concentrations in the samples and thus lower partitioning rates to solids. In the present study, the idea of using a sequential ultrafiltration method arose from the necessity to decrease the final volume of the viral concentrates during the COVID-19 pandemic, when the supply of the commonly used ultrafiltration devices was limited, and there was a need for the development of alternative viral concentration methods.

Virus concentration from environmental water and wastewater samples is a challenging task, carried out primarily for the identification and quantification of viruses. While several virus concentration methods have been developed and tested, we demonstrate here the effectiveness of ultrafiltration and skimmed milk flocculation for RNA viruses with different sample types.

スキムミルク凝集と限外ろ過を用いた環境水および廃水サンプルからのウイルス粒子の濃縮

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

レンチウイルスの生産

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

生物学

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

水サンプル中のウイルス検出のための利用ポイント方法VirWaTest

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...