私たちは、アレナウイルスの逆遺伝学技術とプラスミドの開発·改善のためのJCTとLM-S研究所で過去と現在のメンバーに感謝。また、技術的なサポートのためSnezhana Dimitrovaに感謝します。 JUNV NP（SA02-BG12）に対するモノクローナル抗体は、BEIリソース（NIAID生物兵器防衛と新興感染症研究資源·リポジトリ）から得た。 BYHCは、インスティテューショナル·ルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞からグラント番号GM068411によってサポートされていました。 EO-Rはフルブライト-Conicyt（BIO 2008）とロチェスターワクチンフェローシップ（2012）受取人である。 EO-R現在のサポートは、ロチェスター大学のファカルティ·ディベロップメント＆多様性事務局からダイバーシティ＆アカデミック優秀ポスドクフェローシップによって提供されます。 LM-S研究室の研究は、NIHの助成金RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、インフルエンザ研究および監視のためのエクセレンスNIAIDセンター（HHSN266200700008C）によって資金を供給され、生物兵器防衛免疫モデリング（HHSN272201000055C）用ロチェスターセンターの大学。 JCT実験室での研究は、NIHから助成金RO1 AI047140、RO1 AI077719とRO1 AI079665によってサポートされていました。

1。アレナウイルスレスキューフェ私達の救助システムは、核タンパク質（NP）、およびRNA依存-RNA-ポリメラーゼ（L）、RNA複製およびアレナウイルスゲノムの遺伝子発現に必要なウイルスのトランス作用因子をコードするポリメラーゼIIのタンパク質発現プラスミドの両方の使用に基づいていた7、19、およびSとLアンチゲノムRNA種の細胞RNAポリメラーゼI（POL-I）、7を介して細胞内合成を指示することができるプラスミド、。我々の研究では、私がプロモーターとマウスターミネーター配列（ 図2）人間のポリメラーゼを使用pCAGGsタンパク質ニワトリβ-アクチンプロモーターとpolyadenylanation（PA）シグナル配列を使用して発現プラスミドと、人間POL-Iプラスミドを使用。 S及びL RNAセグメントはHPOL-Iによる転写時のゲノムRNAセグメントの生成を可能にするためにアンチゲノム向きでHPOL-Iプラスミドにクローニングする。野生TYの救助のためにPEの組換えLCMV（rLCMV）とスナップ＃1（rCandid＃1）pCAGGs NPおよび各ウイルスのLは、それぞれのヒトPOL-I SおよびL RNAセグメント（ 図3）と一緒に同時トランスフェクトした。換えtrisegmented LCMV（r3LCMV）、＃1（＃1 r3Candid）スナップ写真の世代は同様のプロトコルに従ったが、S·セグメントは、2つの異なるPOL-I Sプラスミド、各エンコーディング独特レポーター遺伝子に分割されました：1で、NPオープンリーディングフレーム（ORF）は、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子（HPOL-I S GFP / GP）で置換し、他方に、ウイルス糖タンパク質前駆体（GPC）ORFは、 ガウルシフェラーゼ（Gluc）レポーター遺伝子で置換され（HPOL-I S NP / Gluc）。プロトコルの概略図を図4に示されている。次のトランスフェクションおよび感染プロトコルを6ウェルプレートのために確立されている。 <ol><li> OptiMEM中-リポフェクトアミン2000（LPF2000）混合：OptiMEM中メディア250μlのを準備し、依存トランスフェクション当たりLPF2000の12μgの（1μgの/μl）を（ 表1） -ウイルス救助、10。 DNAのμgのあたり2.5μgのLPF2000の比率が推奨されます。 RTで10分間 - 5インキュベートする。一方、別のマイクロ遠心チューブ（ステップ1.2）でプラスミドトランスフェクション混合物を準備します。 </li><li> プラスミドDNAのトランスフェクション混合物：各ウイルスの救助のための推奨量（ 表1を参照）を使用して、マイクロチューブにプラスミドのトランスフェクションカクテルを準備します。 OptiMEM中で50μlに、最終容量を持参してください。 </li><li> OptiMEM中-LPF2000-DNAプラスミド混合物：プラスミドDNAのトランスフェクション混合物（ ステップ1.2）にOptiMEM中-LPF2000混合（ ステップ1.1）250μlのを追加します。室温で30分間 - 20で、この混合物をインキュベートする。一方、トランスフェクション反応あたり1×10 6 Vero細胞を準備し、数える。ベロ細胞は、懸濁液中にトランスフェクトされる。 </li><li> Vero細胞の調製：ベロCELLSを100mm皿で培養される。開始する前に、37℃に1×PBS、DMEM 10％FBS、1％PSメディア、トリプシン-EDTA混合物をもたらす<ol><li> 1X PBS 5mlで、二回、細胞を洗浄。 </li><li>トリプシン-EDTA 1 mlの細胞をトリプシン処理し、細胞のデタッチ（約5分）になるまで待ちます。ジェントルタップは多分完全に皿から細胞を分離するために必要。 </li><li>慎重を15mlの遠心分離管中DMEM、10％FBS、1％PS 10mlの細胞懸濁する。 </li><li>遠心分離機で1,000 rpmで5分間、細胞を遠心分離します。 </li><li> DMEM 10％FBS、1％PS 10mlの細胞を再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの濃度を調整します。トランスフェクション当たり1×10 6個のベロ細胞最良の結果が得られた-それは0.5ことが観察された。 </li></ol></li><li> LPF2000/DNA、細胞を混ぜる：20後- 30分室温でのインキュベーション（ ステップ1.3）にVero細胞を1ml（1×10 6）（ ステップ1.4）を追加室温で5分間OptiMEM中-LPF2000-DNAプラスミド混合物とインキュベート。 </li><li> シード6ウェルプレートにLPF2000/DNA-cellミックス：6ウェルプレートのウェルにDNA-LPF2000-ベロ混合物（ ステップ1.5）を追加します。ゆっくり6ウェルプレートを振ると℃、5％CO 2、37℃インキュベーターで一晩クションインキュベートしてみましょう。 </li><li> トランスフェクション培地変更：約16から24時間後にトランスフェクションし、トランスフェクションのメディアを取り出し、感染培地2 mlを加え、さらに48時間トランスフェクトされた細胞を培養する。 </li><li> セル通路：感染媒体でのインキュベーションの48時間後、組織培養上清（TCS）を取り外し、100ミリメートル皿にトランスフェクトした細胞を渡す。トランスフェクトされた細胞は、ウイルス粒子を生成するために追加のインキュベーションを必要とするので、TCSはほとんど感染性ウイルスを含まない。セル通路の場合： <ol><li> 1X PBS 2mlで、二回、細胞を洗浄。 </li><li>細胞のwトリプシン処理<html> i番目の0.5トリプシン-EDTA mlの細胞がデタッチされるまで待ちます。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブでDMEM 10％FBS、1％PS 1mlに細胞を再懸濁します。 </li><li> 5,000 rpmで5分、4℃遠心で細胞を遠心分離します。 </li><li>慎重に感染媒体1mlに細胞を再懸濁し、100ミリメートルシャーレに細胞を移す。 8ミリリットル、ウイルスを濃縮するためだけでなく、細胞の乾燥を防ぐために十分なボリュームに、感染媒体と、プレートの総容積を持ち出す。 </li></ol></li><li>ゆっくりと100ミリメートル皿を振ると72時間℃で、5％CO 2、37℃インキュベーター内でVero細胞のインキュベーションを続ける。 </li><li> TCSのコレクション：72時間のインキュベーション後、15ミリリットルの遠心チューブにTCSを収集します。遠心分離機で2,500 rpmで5分間遠心分離することによって細胞の破片を取り除きます。アレナウイルス感染がTCSで発見されているので、細胞破片ペレットから削除して、-80℃でTCSを保管℃に</li></ol>組み換えアレナウイルスレスキュール &quot;&gt; 2。確認 rLCMVとrCandid＃1の成功救助の検出は、焦点形成ユニット（FFU）免疫蛍光アッセイ（IFA）によって達成される。野生型ウイルスの救助のために我々はウイルスのNPに特異的な抗体を使用しています。 r3LCMVとr3Candid＃1は、このように蛍光顕微鏡（GFP）および/または発光（Gluc）によって抗体を必要とせずに、ウイルス検出や滴定を可能にし、2のレポーター遺伝子（GFPとGluc）エンコード。 <ol><li> 野生型組換えアレナウイルス救助確認： - 90％コンフルエントに翌日（4×10 4細胞/ウェル）滴定の前日を、PBSで2回Vero細胞を洗浄し、80に到達する96ウェルプレートをトリプシン処理し、準備します。優しく細胞の制服を着た分布を得るために手でプレートを振る。文化細胞、一晩、37℃のインキュベーター5％CO 2で。感染症に進む前に、単層を確認するために、顕微鏡下で細胞を確認します。 <ol><li>シリアル希釈（10倍希釈）ウイルス含有TCSはOptiMEM中さ100mmディッシュ（ ステップ1.10）でトランスフェクションされた細胞から回収した。 </li><li>播種ベロ細胞からメディアを取り出し、1×PBS50μlので二回洗い、希釈したウイルス（ ステップ2.1）50μlの細胞に感染。 37℃および5％CO 2を 1.5時間細胞に感染。 </li><li>感染後、ウイル​​ス接種を削除100感染媒体のμL/ウェルを加え、16細胞をインキュベート - 18時間。ウイルスの再感染は、ウイルス力価の過大評価につながる可能性がある、18時間のインキュベーション後に発生する可能性があります。 </li><li> 16時 - 18時間感染後、各ウェルからTCSを除去し、室温で15分間、1×PBSで希釈し、4％ホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li>次に、定着液を除去し、細胞を透過性に0.1％のトリトンX-100、室温で10分間、1×PBSで希釈した。 </li><li>透過液を吸引し、3回のWi細胞を洗浄番目1X PBS。 </li><li> RTで1時間1×PBS（ブロッキング溶液）で2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞を遮断する。あるいは、細胞を4℃で一晩ブロックし、抗体のインキュベーション翌日に継続することができる。 </li><li>一方、一次抗体を作製。ブロッキング溶液内LCMVと率直＃1-特異的な一次抗体を希釈した後、3,500 rpmで15分間/ブロッキング溶液抗体を遠心。 BEIリソース（1:500希釈）からのモノクローナル抗LCMV NP抗体クローン1.1.3（1：30希釈）16及びモノクローナル抗JUNV NP抗体SA02-BG12はrLCMVとrCandid＃1の検出のために用いることができるそれぞれ。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、ブロッキング液を吸引し、細胞への一次抗体を50μlを加え、37℃で1時間インキュベート℃で</li><li>この時点で、ブロッキング溶液に二次抗体を希釈した後、3,500 rpmで15分間抗体/ブロッキング溶液を遠心する。ポリ一次モノクローナル抗体の検出のためのクローンウサギ抗マウスIgG二次抗体をFITCは、 図5で観察画像を得るために使用された。 </li><li> 1時間のインキュベーション後、1×PBSで3回洗浄し、一次抗体を吸引し、37℃で30分間、二次抗体を加え℃で</li><li> 30分間のインキュベーションの後、二次抗体を吸引し、1×PBSで3回洗浄する。細胞は両方ミリリットル（FFU / ml）を形成単位焦点をカウントによるウイルス救助や滴定の成功を決定するために、蛍光顕微鏡を用いて観察することが今準備ができています。 </li></ol></li><li> r3LCMV、＃1 r3Candidウイルスのレスキュー：これらのウイルスは、2つのレポーター遺伝子を発現するので、それらは、GFPの発現またはTCSでGluc発現を検出するために蛍光顕微鏡法によってモニターすることができる救う。救助はまた、TCSのGlucの発現によって確認することができる。 trisegmentedウイルスを滴定するために、我々はステップ2.1〜2.1.4に従って、しかし、細胞がBにする必要はありませんeはためGFP発現の正常なウイルスの救出を決定するために修正しました。ウイルスの力価測定は、FFU / mlに計数することによって決定される。 Gluc発現による成功ウイルス救出を決定するには、TCSからGluc式がGlucアッセイキット（Biolux ガウルシフェラーゼアッセイキット、New England Biolabs社）を用いて測定することができる。そのために： <ol><li> 96ウェルホワイトプレートにTCSのピペットで100μlの（平底マイクロタイタープレート、フィッシャーサイエンティフィック）。 </li><li>ルミノメーター（LumiCount、パッカードBiosciences）を設定します。 </li><li>各サンプルに100μlのGlucアッセイ溶液（としてメーカーが推奨）とルミノとGlucレポーター遺伝子発現を測定 - 50を追加します。陰性対照として、野生型ウイルス感染細胞からのTCSのGluc発現を測定した。 </li></ol></li></ol> 3。組織培養上清のパッセージウイルスの救助はトランスフェクション効率に依存します。 Vero細胞が示されている他の細胞株14よりも低いトランスフェクション効率を持っている。 TCS中のウイルス力価が低い場合には、ウイルスを増幅するために72時間0.01（LCMV）または0.1（＃1スナップ写真）の感染多重度（MOI）で新鮮なVero細胞に感染する。

<ol>
	<li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain.">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li><li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+a+neglected+central+nervous+system+pathogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).</li><li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviridae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenaviridae: The viruses and their replication.</a> Fields' Virology. 2, 179201827 (2007).</li><li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirus+reverse+genetics:+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies.">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li><li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest.">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li><li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I/II-driven+cDNA.">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li><li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+virus.">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li><li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever.">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li><li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa.">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li><li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function.">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li><li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV)+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs.">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li><li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis.">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li><li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus:+its+application+for+H5N1+vaccine+production.">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li><li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li><li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses.">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li><li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses.">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li><li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses.">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li><li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid.">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

プラスミドベースの逆遺伝学的手法を用いて組換えアレナウイルスの生成は、アレナウイルス生物学のさまざまな側面の研究のために広く使われているアプローチとなっています。ここでは、アレナウイルスを実行して、現在のシステムに不可欠な改善を文書化し、他の感染症に対するアレナウイルスとワクチンベクターに対するFDAの承認を受けたワクチン候補の電位発生を可能にし、Vero細...

アレナウイルスは、 アレナウイルス科に属するbisegmented、マイナス鎖RNAゲノム3エンベロープウイルスである。アレナウイルスゲノムは3 2つの別々のウイルスのセグメントからambisenseファッションの4つのタンパク質をコードしている。大（L）セグメントは、出芽ウイルスの主要な原動力として機能するRNA依存性RNAポリメラーゼ（L）と小RING（実際おきたい新規遺伝子）フィンガータンパク質（Z）をコードする。小（S）のセグメントは、ウイルス核タンパク質（NP）と表面糖タンパク質（GP）（ 図1）をコードする。 アレナウイルス科のいくつかのメンバーは、人間3で致死性出血熱（HF）を担当しています。原理上の問題の入院患者8、図9において高い死亡を引き起こすことが知られているラッサウイルス（LASV）とフニンウイルス（JUNV）がある。これらのウイルスは、それぞれ西アフリカと農村アルゼンチン、固有種であるが、増加した旅行10に起因する非流行地域へLASVとJUNVの輸入の増加が懸念される。通常、ヒトの重篤な疾患に関連付けられていないものの、さらに、原型アレナウイルスリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）は免疫不全患者6、15に致命的感染症の場合があったように無視された病原体とみなされ、先天性先天性欠損症と自然流産の責任です妊婦2、13インチ現在アレナウイルスと治療に対して何の米国FDAの承認を受けたワクチンが存在しない部分的にしか有効であり、多くの場合、重大な副作用に関連付けられているヌクレオシドアナログリバビリン、に限定されています。 プラスミドベースのリバースジェネティクス4および組み換えアレナウイルス7、19の世代の導入は大幅アレナウイルス研究の分野を進めてきた。現在、齧歯類細胞（例えば、BHK-21など）GENERのために使用されるSとLのセグメントの初期の転写を誘導する種特異的ネズミRNAポリメラーゼI（POL-I）プロモーターによる換えアレナウイルスのATION。 BHK-21細胞におけるウイルスしかし救助は、潜在的なワクチンシード候補として換えアレナウイルスの生成のための承認された方法ではありません。ここでは、原型旧世界（OW）LCMVと新世界（NW）Vero細胞におけるJUNVスナップ＃1株の効率的な救助のための人間のPOL-Iプロモーターを使用することを文書化します。類似した方法論を用いて、我々は、組換えtrisegmented LCMV（r3LCMV）と2つの異なるS RNAセグメント5でエンコードされた二つの追加外来遺伝子が含まれている（＃1 r3Candid）＃1スナップアレナウイルスを生成しました。この新しいシステムでは、再現性の高い、シンプルなプロトコルに従いますが、すぐに潜在的なワクチンまたはワクチンベクターのシードとして換えアレナウイルスの生成で実装することができませんだけ。

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material and methods</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

アレナウイルス逆遺伝学の開発と実装は、アレナウイルスフィールド4の重要な進歩を表しています。彼らのゲノム内の所定の変異を有する組換え伝染アレナウイルスを生成する機能と一緒にセルベースアレナウイルスミニゲノムシステムの使用は、アレナウイルスのライフサイクルの異なる段階にウイルス決定因子の寄与の調査だけでなく、ウイルスのホストを促進してきたアレナウイルス病因1、3、11の相互作用とメカニズム。また、trisegmentedアレナウイルスの開発は、このようアレナウイルスベースのワクチンベクター·アプリケーション5の可能性を開いて、関心のある付加的な外来遺伝子を発現するアレナウイルスゲノムの利用を許可している。同様に、レポーター遺伝子を発現することができる単一サイクル感染アレナウイルスの開発がhighlて研究の安全性を向上させるために新しい実験ツールを提供Y病原人間アレナウイルス16。プラスミドに基づく逆遺伝学技術を用いた組換えアレナウイルスの生成は、これまでの食品医薬品局の開発（FDA）認可されたワクチンまたはワクチンベクターのためのいくつかの障害を引き起こし7,19齧歯類細胞株の使用に頼っている。この障害を克服するために、我々は、FDAが承認したVero細胞における組換えアレナウイルスの効率的な世代はここに記述します。

組換え野生型アレナウイルスの成功救助はIFAます（ 図5）を使用してウイルス抗原の存在によって確認されます。組換えウイルスtrisegmented、成功したウイルスのレスキューの場合、蛍光顕微鏡（ 図6A）によってGFP発現を観察することにより評価することができる。成功した救助はさらにGluc式（ 図6B）を評価することによって確認される。野生型およびtris...

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K ビュー.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの?...

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

免疫・感染学

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

アデノウイルス血清型5ベクターワクチンアプローチの開発のための抗原キャプシド取り込み戦略を活用

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.