この明確に定義されたプロトコルは、哺乳類における一次神経堤の移動を調べています。私たちは、神経堤に影響を与える出生時欠損を研究するために、一次神経堤の移動を使用します。このアプローチは、神経プレートから出てくる神経堤細胞を詳しく見ることができます。
変異遺伝子アリュールを持つ組織や医薬品治療後の細胞行動の試験により、胚発生時の薬物治療や環境変化の影響に対する健康スクリーニングが可能となる。同様のアプローチは、心臓や腸に移動する神経堤細胞を研究したり、転移性腫瘍細胞を研究するために使用することができます。胚の解剖学を推測することは困難です。
その組織は、初期の開発中に非常に急速に変化します。大きな実験を行う前に、マイクロディシスを実践することをお勧めします。胚は生きていて3次元なので、スピードと精度が重要です。
胚の日8.5では、無菌のツールと溶液を使用して、子宮を氷冷PBSの容器に収穫します。各胚を分離するためにメソームトリウムをカットします。子宮を慎重に解剖し、各十分な腫れを分離する。
適切な発達段階で胚を収穫することは、変動性を減らし、細胞移動と同様に外植物の接着における成功を高めるために重要である。筋肉層と胚のデシデュアル組織の間で鉗子をスライドさせ、筋層を除去するために2番目の鉗子を使用する。鉗子を使用して、メソームリープルの端にデシドゥアを突き刺し、2番目の鉗子を使用して、プルに垂直に開いた組織を引き裂きます。
慎重に膜を除去する前に、リカート膜を視覚化するために鉗子でデシデュアル組織を剥がします。内臓黄身嚢が見えるようになり、胚は内部で観察されます。内臓黄身嚢とアニオンを取り除き、胚を配置して頭部の折り目を視覚化します。
頭を心臓の上に折り畳み、下層の中皮を削り取り、きれいな神経板を得る。その後、神経プレートの境界線を解剖する必要があります。ガラス製のパスツールピペットを使用して、解剖されたニューラルプレートを、コンディショニングされたニューラルクレスト媒体で満たされたヒドロゲルコーティングされた皿に移し、皿をそっと旋回して井戸の真ん中に神経プレートを配置します。
次に、適切な実験期間に対して摂氏37度、炭酸ガス5%で神経プレートをインキュベートします。24時間の出植後で、組織培養皿を顔コントラスト顕微鏡の標本ホルダーに入れ、プレート蓋と二酸化炭素針をテープで留め、マルチウェル取得時の揺れを防止する。次に、選択したコンデンサで一致する位相リングを使用して、10倍の倍率で頭蓋神経堤細胞に焦点を当てます。
神経堤細胞移動能力を定量化するために、顕微鏡を10倍の倍率で5分ごとに1フレーム取得するように設定します。細胞形態を定量するために、顕微鏡を40倍の倍率で毎分1フレーム取得するように設定する。ラメリポディアダイナミクスを定量化するには、顕微鏡を10秒ごとに10分間1フレームずつ40倍の倍率で取得するように設定します。
マルチウェルイメージングの場合、選択したX、Y位置の間を移動するように機械的なステージを設定し、頭蓋神経堤細胞が焦点を合わせ、ステージ位置が正しいことを確認します。次に、[取得] をクリックして、タイムラプスイメージングを開始します。単一セルトラッキングの場合は、イメージ J を開き、データを tiff スタックファイルとしてインポートします。
方向と明るさとコントラストのレベルを変更し、クリックして分析し、顕微鏡の設定に従ってピクセルマイクロメートルでドットstkファイルを較正するためにスケールを設定します。プラグイン、トラッキング、手動トラッキングをクリックして画像J手動セルトラッキングプラグインを開き、追跡を追加してセルトラッキングを開始します。次に、核を基準点として使用して、タイムラプスムービーのすべてのフレームを通して細胞を追跡します。
ニューラル・クレスト・マイグレーション能力を評価するには、適切な移行分析ソフトウェア・プログラムを開き、「データのインポート」タブをクリックして、セル追跡データをドット・txtファイルとしてインポートします。[データセットと初期化]で、分析するスライスまたはフレームの数を選択し、X Yキャリブレーションとフレーム間の時間間隔を設定します。[設定の適用] を選択して、設定を保存します。
次に、軌道プロットを形成するプロットデータシンボルを選択し、統計シンボルを選択して距離と速度の測定を定量化します。神経堤細胞領域と円形度を定量化するには、画像 J を開き、分析および測定を設定する下で、セル形状パラメータ、セル領域、周長、および形状記述子をクリックして選択します。自由手選択ツールを使用して、細胞膜境界をガイドとして使用して、各セルの周囲にアウトラインを手動で描画します。
キーボードの Control + B キーを押して、画像上のセルのアウトラインオーバーレイを維持し、各時間経過フレームにわたって各セルに対して繰り返します。画像のオーバーレイをクリックし、関心のあるマネージャーに到達し、関心のあるセルを選択します。次に、[メジャー] をクリックして、目的の選択したセルシェイプ パラメータの値を取得します。
外植および培養の24時間以内に、前回遊性上皮頭蓋神経堤の領域が神経板外植の周囲に明らかに観察され得る。さらに、神経堤細胞の亜集団は、間葉転移に上皮を受け、完全に間葉に現れるであろう。外植培養物は、細胞外マトリックスベースのヒドロゲルまたはフィブロネクチンのいずれかにメッキされ、神経プレート前回遊性神経紋および回遊性神経堤細胞集団からなる類似の外植構造を形成する。
しかし、フィブロネクチンにメッキされた外植は、移動方向により偏光しているように見える細胞のリーディングエッジでより顕著なラメリポディアを有する細胞を産生する。タイムラプス顕微鏡は、個々の細胞のX、Y座標の追跡、および神経堤細胞の移動の分析と時間の経過に関する頭蓋神経堤細胞形態の解析を可能にする。個々の細胞膜を概説することにより、細胞面積および周長の測定値を、その映画のすべてのフレームから計算して、その後の細胞面積の定量と、個体および細胞群の円形性を可能にすることができる。
細胞が外植から離れて移動するにつれて、細胞領域は著しく増加し、細胞の円形性は比較的一定のままであり、細胞が上皮端から逸脱し、細胞間接触に細胞を失うにつれて、細胞の広がり領域が増加することを示唆している。これは組織から離れて神経堤細胞の移動を促進するように、きれいな神経プレートを得るために下層の中皮を掻き取るために特に注意を払う。免疫染色、RTPCR、単一細胞解析などの他の多くの技術を、異なるタンパク質または異なる培養細胞の集団間で目的の遺伝子を解析するために実行することができる。
私たちは、神経堤細胞の移動に関与し、このアプローチを使用してヒト疾患遺伝子を研究する重要な神経芽細胞腫遺伝子の発達ロールに興味を持っています。
