作業はHelse OG Rehabilitering（JLB）、ノルウェーの研究評議会（GHとJCG）とオスロ大学（NKとJCG）からの補助金によって支えられて。

1。胚に注入するためのヒト幹細胞と準備の単離および培養<ol><li>このプロトコルの例（脳、脂肪、骨髄）として使用されるヒト幹細胞は、異なる組織とは異なる方法で分離されています。例えば、成人の神経幹細胞はin vitroで培養されている個々の細胞にして解離して内視鏡外科、中脳の脳室壁から採取した組織片から分離されています。神経幹細胞は、自発的に他の種類の細胞が培養皿の7の底部に付着しながら培養培地中に浮遊するニューロスフェアを形成する。脂肪由来間葉系幹細胞は酵素消化し、線維組織を除去するために緊張して、成熟した脂肪細胞を取り除くために遠心分離された脂肪吸引の材料から得ています。得られた細胞は、他の細胞タイプ8造血幹細胞および前駆細胞を介して幹細胞の増殖を促進するために血清を添加した培養液で再懸濁した磁性粒子（Myltenyi Biotec社、ドイツに結合した特異的な抗体を用いてポジティブセレクションによるヒト骨髄液から単離することができるまたはDYNAL -インビトロジェン社、米国）と磁気細胞分離、および/ ​​または蛍光物質および蛍光活性化細胞選別（FACS）9〜標識抗体を使用。 </li><li>ニワトリ胚に移植前に蛍光マーカーを後で識別、ラベル幹細胞を容易にする。幹細胞は、宿主細胞を汚染の本質的に危険性がないとの永続的なラベルのため、すぐに着床前までのサプライヤー推奨のプロトコルを使用してこのようなDII（インビトロジェン社、米国）またはPKH26（Sigma、米国）等の蛍光親油性色素で標識し、またはすることができます彼らはまだ文化10の間に、レンチウイルスベクターを使用して、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の遺伝子を形質導入することができます。 </li><li>ヒト幹細胞の培養と増殖のためのプロトコルは異なります。詳細なプロトコールは、文献で見つけることができます。接着幹細胞は通常、適当な培地で、（時分割粉砕を容易にする、下記参照）ペトリ皿で​​培養されているのに対し、簡単に言えば、球形成幹細胞は、通常、フラスコ内で培養されています。分割または収穫のため、1200rpmで5分の遠心分離によってペレット球形成細胞と37℃でせいぜい5分間予め温めておいたトリプシン/ EDTA溶液で再懸濁します。接着細胞用シャーレにトリプシン/ EDTA溶液を加え、5分間の最後でひいて粉にする。時にはアルブミンで補完のCa 2 +含有培地を、追加することによって、トリプシン処理を終了します。トリプシン/ EDTAを削除するには、細胞を（1200rpm、5分間）遠心分離、コールドインジェクション車（通常は培地またはリン酸緩衝生理食塩水）で再懸濁し、上清を、削除し、（1200rpmで5分）、再度遠心する。この上清の大部分を削除して、ゆっくりと高濃度の細胞懸濁液を作成するために細胞を懸濁します。 </li><li>最大で数時間前まで注射まで氷上で小さな、キャップ付きバイアルまたはマイクロ遠心チューブにヒト幹細胞の懸濁液を保管してください。この状態での生存率は細胞タイプに依存する可能性があります。インジェクション車両は、その接着力（例：低Ca 2 +車両が凝集防ぐことができる）と低酸素とpHの変化に対する抵抗を含めて、細胞の性質に応じて最適化されている必要があります。 </li></ol> 2。卵の孵化と準備<ol><li> ° Cインキュベーション前に14〜15時：冷却室（Termaks、ベルゲン、ノルウェーなど）で受精卵を保存してください。インキュベーションが開始されるまでこの温度の開発で逮捕されている。約10日間以上またはより低い温度で保存された受精卵は、その後の発展と生存率の低下を持っている。 </li><li>加湿、強制通風インキュベーター（例：バインダー、ニューヨーク、米国）に卵を置く、開発の再開への° Cは38から39までで、開発の必要な段階に到達するまでインキュベートする（ステージング用、refを参照してください11。 ）。 </li><li>卵を開く前に、（図A）卵の殻（あまりにも深く卵黄にピアスを避けるために）を介して18ゲージの注射針を挿入し、アルブミンの4mlを排気することで胚の上の空気のポケットを作成します。これは数分で多孔質外殻を通過する空気のエントリで、イコライズされた圧力降下を作成します。空気が入るとそれは、このようにシェルの内面から胚を分離し、シェル内で最も高いポイントで収集します。 </li><li>従来のプラスチックテープで注射器の針で作成された穴を塞ぐ。 </li></ol> 3。ガラスのマイクロピペットを引っ張る<ol><li>従来の電極プラー上のホウケイ酸ガラス（例えば、1.2ミリメートル外径× 0.94ミリメートルのID、ハーバード装置、米国）（例えば、モデルP - 2000、サターインスツルメンツ、米国）からガラスのマイクロピペットを引き出します。 microelとして使用した場合、高入力抵抗を持っているマイクロピペットを得るためにプーラーの設定を調整しますectrodes。ヒントは、約1〜1.5センチメートル長いはずです。シャフトは、取り出されたボリュームを計算する1 mm間隔でマークすることができます。 </li><li>鉗子でそれらを曲げたり、顕微鏡で見ながら、固体表面に対してそれらを押すことにより実行可能なサイズにマイクロピペットの先端を破る。ブレークは、ガラスの周囲などにも可能な限りでなければならず、先端における結果の内径が詰まることなく、使用する細胞の大きさに対応する必要があります。通常は20〜30ミクロンの内径はうまく動作します。 </li></ol> 4。ファストグリーン色素溶液の調製（試薬を対照的な） <ol><li> （137 mMのNaCl、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、1mMの鶏生理食塩水に溶解してファストグリーン色素（Sigma - Aldrich社、米国）の0.1％（w / v）溶液を準備するのNa -リン酸、5mMのHEPES、11 mMグルコース、pH7.4）に。 </li><li> 0.22μmのマイレクスGPフィルター（ミリポア社、ベッドフォード、米国）を介して高速グリーンソリューションをフィルタリングする。 </li></ol> 5。卵を開くと胚を対照<ol><li>エアポケットの大きさをカバーする、卵の上にテープの2個を置きます。卵の向きを保つことは録音されたエリア（と、空気のポケットが）一番上になるように、頑丈な解剖鋏を使って録音された領域の境界線の中に小さなウィンドウをカット。テープはサポートが追加され、胚に落下するから卵殻の破片を防ぐのに役立ちます。エアポケットに関連付けられている気泡は、プラスチック製のピペットチップまたは他の鈍プローブのバックエンドを使用してポップすることができます。 </li><li> 25ゲージの針を1 mlシリンジにいくつかのファストグリーンソリューションを描く。注射器と針で気泡を取り除く。 45度の角度に針を曲げたり、胚性プレート（それを外接血管のリングで識別される、胚性プレートの増加、死亡率の中ピアス）の外側の点で侵入し、慎重に胚の下に針先をご案内。希望のコントラストが得られるまで色素を注入する。通常は透明である胚は、、今暗緑色（図B）に対して白っぽい幽霊として頭角を現すはず。多くの研究者らは、インドのインク（10％v / vのために希釈）ではなく、ファストグリーンを使用してください。このケースでは、ペリカンファウントインディアインクのような、非毒性であるインドのインクを使用することが重要です。 </li></ol> 6。後脳と脊髄神経管の病変を作る<ol><li>アセチレン/酸素トーチで、直径100μmのタングステンロッド（カタログ番号719000、A＆Rシステム、シアトル、ワシントン州）の短い（2-3センチ）の部分を難エッチングによるシャープタングステン針を生産する。これは、火花が見えるまで鋭い先端を残して、タングステンの外側の層の爆発的な浸食を表す、トーチ炎に非常に簡単にロッドの先端を挿入することによって行われます。 </li><li>シャープタングステン針を用いて、通過スライスし、顕微鏡のためのエリアをカバーして卵黄膜を偏向させる。 </li><li>第二シャープタングステン針を（最初の針の先端はしばしば卵黄膜を介してスライスした後、破損やその後の顕微鏡に適合されていない）を使用して、神経管を覆う上皮を通して慎重に切り取って、それを偏向させ、その後の周りにカットアンドピースの下に神経管の短い、クイック上向きストローク（図C）を使用して、削除する。縦カット、最初の横カットを作るとすると、通常、最も成功しています。あまりにも深くカットしたり、通常は致命的な基盤となる血管を、貫通リスクにさらさないでください。 </li><li>静かにタングステン針を用いて病変部位から切除した組織片を反転またはドラッグします。これが困難な証明された場合、それはまた、フレキシブルチューブに接続されているガラスのマイクロピペットを用いて口の吸引によって除去することができます。 </li></ol> 7。ヒト幹細胞の注入 A.神経管の病変への注射プラスチック製のチューブを使用して口の吸引によるガラスのマイクロピペットの先端に細胞の少量を描く。細胞懸濁液の使用濃度は、注入される細胞の種類に合わせて最適化されている必要があります。マイクロマニピュレータ上にマイクロピペットをマウントし、インジェクターポンプ（例：PV830空気圧PicoPump、WPI、ワシントン、米国）に接続してください。解剖顕微鏡を使って視覚的な制御の下で、病変にマイクロピペットの先端をガイドし、慎重に空気の圧力（どちら定圧のパルスにより、または徐々に圧力を上昇させて）（図C）を増加させることによって細胞を追放する。細胞の所望量の病変部位内に堆積されている場合、慎重にマイクロピペットを撤回。 B.神経管の内腔への注射細胞は病変の存在下で神経組織へのアクセスを得るのに十分な侵襲であればいくつかのケースでは、例えば、発展途上脳室に細胞を注入することが望ましい場合があります。どんなBRの内腔への細胞の注入AIN地域は、内腔が十分な大きさの容器を提供し、容易にアクセスされる発達段階を使用する必要があります。HHステージ12〜18は、この点で有利です。病変は必要ありません。単に穴を開ける前に、細胞の注入にガラスのマイクロピペットで神経管の壁。この方法の成功の鍵となる要素は、マイクロピペットと浸透のぶっきらぼうな鋭さです。すぎて動きを遅くし、マイクロピペットの先端は貫通せずに神経管の壁をディンプルことができる。 C.全身注射全身注射は、余分な胚の血管（これらの血管がよく発達しているHHステージ15から始まる）を経由して行うことができます。これは、まれに、一部出血を伴って、多くの小動脈と少数の大静脈があるので、それは胚の生存率となると、動脈内注射は、一般的に安全ですされていません。一方、静脈内注射は、心臓への細胞の迅速なアクセスそしておそらく細胞の均等な分布を提供しています。成功注入は標的血管よりも小さい直径を持つシャープなマイクロピペットを必要とする。 （約30度）、横から小さな角度で、その軸に沿って船に近づく。血管が閉塞するために開始されるまで船舶に対してマイクロピペットを押し込みます。その後、事務所、浸透する急激な運動でさらに押し込みます。血液をマイクロピペットの先端に毛細管現象により描画するために見られるまで、ゆっくり引き戻します。細胞の注入は、マイクロピペットの迅速な移動で退避された後、一定の圧力を使用して実行する必要があります。 8。卵のシール<ol><li>注入後、注入した細胞が定着して付着できるように、数分間卵はまだ放置。 （すぐに発生する可能性があると致命的な証明ができる）脱水を避けるために、この残りの期間中にウィンドウの上に湿らせたティッシュやろ紙片を置く。 </li><li>数分と細胞が定着した後、ウィンドウの周りにシェルを乾燥し、従来のプラスチックテープで窓をシール。このシールがタイトであるとはアルブミン（これは多くの場合、その後のインキュベーション中に致命的な証明）の開口部を介して、またはシェルとテープの間に漏れていないことを確認してください。 </li><li>さらなる発展のために強制通風のインキュベーターに卵を交換してください。観察は、ウィンドウの上にテープを除去することにより、一定の間隔で行うことができます。 </li></ol> 9。胚の解剖<ol><li>一度胚が望ましい段階に達している、氷冷生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（窓を覆って、テープが別個に卵殻の二つの部分を可能にするために、最初のカットしてください）​​。のボウルに卵を開口割れ目氷冷生理食塩水は、低体温によって胚を麻酔しています。心臓はすぐに遅くなると数分以内に停止する必要があります。 </li><li>胚体外膜から胚を分離し、refを使用して、それをステージ。 11。 </li><li>シリコーンゴムのフロアがあり、グルコース（137 mMのNaCl、5mMのKClを、2mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、1mMのリン酸ナトリウム、5を添加した酸素生理食塩水を含む解剖皿にそれを転送し、胚を刎ねるmMのHEPES、11 mMグルコース、pH7.4）およびその高速な腹側をピン。腹部と胸部内臓を取り除く。角度のはさみを使用して、脊柱のそれぞれの腹の側面に沿って縦切開を行います。特に後の段階（開発の6日後）で、最初の切開は、最高の脊椎と脊髄の間にスペースが最大になる腰仙部の地域で作られています。脊髄を明らかにするために脊柱の腹側面を取り外します。生理食塩水は純粋な医療用酸素で約10分間隔でバブリングすることにより酸素残っていることを確認してください。 </li><li>慎重に、両側に発生期の背側と腹側の根を切る必要なレベルで脊髄を横断する、穏やかに脊柱管から持ち上げます。脊髄はこの状態で数時間かけて生き残っていくだろうと解剖学12と生理13,14実験に供することができる。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。）アルブミンの避難のための適切なアプローチ。胚の位置と針の位置に注意してください。 B）胚の対照的。胚盤外針の浸透の点に注意してください。 C）一方的な脊髄神経管の病変のための手順の模式図は、細胞移植が続きます。

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利害の衝突は宣言されません。

ニワトリ胚は、異種移植の実験のための便利で多目的な動物モデルである。胚や胎児の発達中に機能的な免疫システムの欠如は、インキュベーションの温度を許容する任意の種由来の細胞の生存と発展を可能にする。ニワトリ胚は、幹細胞（refにレビュー。15）の様々な種類の再生可能性をテストするために使用されている。哺乳類の幹細胞は、彼らがその軸索投射ニューロンを生み出すことができる中枢神経系、を含むニワトリ胚の組織に統合できる、シナプスの接続性と電気生理学的特性は、機能的神経回路の1,2のコンテキストで評価することができる。 外科手術が比較的容易であり、注射ではなく、定位の制御を視覚的に下に行われるため、胚の数は、簡単に一回の実験内の異なる実験条件に対応するために増加することができます。一般的に細胞を4時間の実験中20から30胚に注入することができます。胚のポスト噴射の死亡率は、主要な制限要因である。注意事項は、出血と脱水を避けるように注意する必要があります。自然死亡率の増加で、特定の重要な発達段階があることに注意してください。重要な発達段階の前に暖かい、滅菌チキンリンガー以下の注射と一日の数mLで胚を補うだけでなく、卵のウィンドウは、漏れを避けるために、しっかりと密封されてと志向であることを確認、生存率を向上させます。テープシールによる漏れが発生した場合、テープを取り外し表面および再テープを乾燥させる。一部の研究者は、ウィンドウを密封するためにワックスやガラスまたはプラスチック製のカバースリップを使用してください。死亡率は、偽手術胚対注入で大幅に異なってはいけません。 我々は脳と脊髄の原基にヒト幹細胞の注入にここに焦点を当てているが、幹細胞はまた、他の臓器の原基（例REFの4参照）に注入することができます。各器官は独自の課題となっています。例えば、心臓への注射が原因ピペットの浸透に高い機械的抵抗をしているため、他の一方で注射前に室温に胚を冷却することによって減速することができるの動き、の挑戦することができます。内腔を欠いている器官は、十分な量の注入に対応していない可能性があり、外科的病変は、レセプタクルを作成するために必要となる場合があります。それが組織にヒト幹細胞の統合を促進するため我々の経験では、後の病変組織再生が有利です。細胞はまた、そのような神経堤由来の末梢神経節16,17を含む間葉系誘導体、中に取り込みを達成する手段として分散体節間葉または移行する神経堤などの胚間充織に注入することができます。

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus IX-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

ニワトリ胚は、標準化における細胞の挙動を研究するために、通常の胚と胎児の発育を研究するためと異種移植実験のための古典的な動物モデルである<em&gt; in vivoで</em&gt;環境。ニワトリ胚の主な利点は、低コスト、高いアクセシビリティ、手術操作の容易さと十分に発達した免疫システムの欠如などがあります。ニワトリ胚への異種移植は、細胞増殖、分化と行動、定義されている胚組織のニッチのシグナルに対する細胞の応答、および腫瘍形成能に関する貴重な情報を提供することができます。ニワトリの胚に細胞を移植しても他​​の動物モデルにおける移植実験に向けた一歩になることができます。最近ニワトリ胚は神経原基への移植後のヒト幹細胞や前駆細胞の神経性の可能性を評価するために使用されています<sup&gt; 1月6日</sup&gt;。このビデオでは、ニワトリ胚の発達中の中枢神経系にヒト幹細胞を移植するための手順全体を文書化する。希望の年齢の胚が発達するまでの手順では、受精卵の孵化から始まります。卵殻は、その後開かれ、胚は胚と卵黄の間に色素を注入することで対比される。小病変は、宿主組織へのその後の統合を促進する細胞の沈着のための再生サイトを作成し、顕微鏡を用いて神経管で作られています。我々は、後脳と脊髄を形成し、脳を形成する神経管の一部の内腔に神経管の一部で行われたそのような病変にヒト幹細胞の注射を示しています。胚体外静脈と動脈に全身注射はまた中枢神経系を含む血管組織に細胞を提供する別の方法として実証されています。最後に我々は、さらなる発展の数日後に卵から胚を削除する方法と、その後の生理的、組織学的または生化学的解析のための無料の脊髄を分析する方法を示します。

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

本稿では、ニワトリ胚の中枢神経系の様々な領域にヒト幹細胞を移植するための手法を提案する。これが用意されています<em&gt; in vivoで</em胚組織の環境におけるヒト幹細胞の様々なタイプの増殖と分化を評価するための&gt;モデル。

ニワトリ胚へのヒト幹細胞の異種移植

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

xenotransplantation-of-human-stem-cells-into-the-chicken-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

19.2K ビュー.  University of Oslo. 本稿では、ニワトリ胚の中枢神経系の様々な領域にヒト幹細胞を移植するための手法を提案する。これが用意されています in vivoでモデル。

ビデオ: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生物学

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

ヒト神経幹細胞を数える

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

ヒト神経幹細胞を継代

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

免疫細胞：ヒト神経幹細胞

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HHステージ10ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...