Os autores agradecem os membros do laboratório Lwigale para a crítica do manuscrito. SLG é apoiado por uma L. Ruth Kirschstein NRSA Fellowship do National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL é suportado pelo National Eye Institute (EY018050).

1. Incubar pintinho e ovos de codorna ao estágio desejado Para HH9 embriões, os tempos de incubação típicos variam de 29-33 horas a 38 ° C. 63 <ol><li> Lave todos os restos dos ovos com água morna. </li><li> Organizar os ovos de galinha na bandeja horizontal. Marcar o lado virado para cima com lápis, o que irá corresponder à região onde o embrião será localizado. Incubar ovos de codorna fim brusco para cima. </li><li> Lugar em 38 ° C incubadora umidificada. Ligue balançando função. </li></ol> 2. Prepare ovos para janelas e dissecção <ol><li> Remover os ovos de incubadora, e esterilizar os topos com etanol a 70%. É melhor para pulverizar sobre o etanol e limpe-a rapidamente com uma toalha de papel ou Kimwipe para evitar qualquer absorção de etanol através da casca de ovo. </li><li> Ovo de galinha em um lugar suporte do ovo individual (nós usamos uma placa de Petri forrada com toalhas de papel dobrados, por exemplo, &quot;Kimwipes&quot;). Utilizando uma pinça AA, toque em um pequeno hole na superfície superior da casca do ovo na extremidade pontiaguda do ovo. </li><li> Remover 1,5-3ml de luz a partir de albumina do ovo de galinha, com uma agulha hipodérmica 18 G e ½ seringa de 5 ml. O melhor é inserir a agulha verticalmente dentro do furo, com o bisel voltado para a extremidade pontiaguda do ovo (Figura 2A). Dessa forma, quando a albumina é retirada, há pouco risco de danificar acidentalmente a gema através de sucção. Descarte a albumina. Esta etapa irá diminuir a gema eo embrião dentro do ovo para permitir uma janela a ser aberta na casca do ovo. </li><li> Seque a furo com etanol a 70% como descrito acima e selar com fita adesiva. É importante que a casca do ovo em torno do furo é completamente desprovido de albumina e seco ou o adesivo não veda. </li><li> Com os fórceps AA, toque um outro furo na superfície marcada superior do ovo horizontal, não completamente no ápice. Tome cuidado para não deixar a pinça ir muito longe através da casca, para evitar danificar a gema ou embrião. </li><li> EmSert um lado das pinças curvas íris em paralelo o furo para a concha de ovos. Beliscar para baixo no shell, trabalhando em um movimento circular para quebrar um ~ 2 cm de diâmetro na janela de casca de ovo de galinha. Deite fora a casca removida. Alternativamente, cobrir a superfície superior do ovo com a fita da embalagem e usar um par de tesouras para cortar a janela. Isto minimiza a possibilidade de detritos da casca do ovo cair para dentro do ovo. O embrião deve aparecer como um disco opaco na parte superior da gema. Descarte todos os ovos não fertilizados (identificado por pequena mancha branca na superfície da gema, ou ausência de blastoderme). </li><li> Injectar uma pequena quantidade de tinta da Índia (diluído 1:10 em solução de Ringer estéril, contendo &quot;Pen / Strep&quot; antibiótico: concentração final de 100 ug / mL de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) por baixo da blastoderme para ajudar com paragem do embrião. Utilizar uma seringa de 1 ml e 26 ½ G agulha hipodérmica, dobrado em um ângulo de 45 ° na base da agulha, com o bisel voltado para cima, alternativamente, uma may usar um puxado vidro pipeta Pasteur e aparelhos boca pipetagem (óculos de protecção quando dobra agulha hipodérmica ou quebrar agulha de vidro). Punção membrana da gema fora do perímetro da blastoderme e deslize a ponta da agulha debaixo do embrião, perto da superfície da gema, mas não nas camadas embrionárias (Figura 2B). Injectar apenas tinta suficiente para delinear o embrião, então, cuidadosamente, retirar a agulha (Figura 2C). Injetando a tinta em excesso pode levar à morte do embrião. É importante que não se injectar quaisquer bolhas de ar por baixo do embrião, como esta pode ser uma fonte de contaminação. NB: Todos solução de Ringer utilizado neste procedimento é esterilizada e contém Pen / Strep, tal como definido acima. Fosfato estéril tamponada (PBS) é também uma alternativa aceitável para a solução de Ringer em todos os passos de este protocolo. </li><li> Encenar o embrião de acordo com Hamburger e Hamilton 63 e gravar o estágio na casca de ovo com tinta permanente ou lápis. Estágios são melhor avaliados em estéreoomicroscopy, com fibra óptica &quot;gooseneck&quot; fontes de luz que têm uma carga de calor limitada. </li><li> Aplicar 2-3 gotas de solução de Ringer estéril aquecer para a superfície do embrião para evitar a desidratação e contaminação. Selar temporariamente a janela com parafilme esticada sobre a superfície do ovo. </li><li> Repita os passos de 2,2-2,9 com todos os ovos de galinha antes de iniciar os experimentos de transplante. </li><li> Uma vez que os embriões de codorniz são utilizados apenas para os tecidos de dadores, em passos ovo 2,2-2,9 pode ser omitida. Para a preparação ovo ex de embriões de dadores, ovos de codorna são incubados lado franco e abriu nesta região com pinças curvas para revelar o embrião. Com uma tesoura de dissecção, fazer quatro cortes na forma de um quadrado através da membrana vitelina e blastoderme fora do embrião (certifique-se que todos os cortes se encontram). Usando um fórceps curvos íris, suavemente compreender um bordo de corte e levantar o embrião do ovo e transferi-lo para solução de Ringer numa placa de Petri. Alternativamente, pode-se usar a curvad íris fórceps para levantar o embrião excisado a partir de baixo, ou uma colher embrião ou pipeta de transferência de plástico cortar através da parte mais larga do cilindro, pode ser usado para transferir o embrião para fora do ovo. Remova cuidadosamente a membrana vitelina com # 5 fórceps. Colete os embriões restantes de codorna como acima, e organizar-las sob um microscópio de dissecação. </li></ol> 3. Preparar o embrião hospedeiro para receber o enxerto <ol><li> Remover parafilme a partir do hospedeiro (pintainho) embrião e usando uma agulha de tungsténio afiada ou # 5 fórceps, rasgar um pequeno orifício na membrana vitelina na região desejada do tubo neural (Figura 3A). </li><li> Adicionar uma gota de solução de Ringer para o embrião. Tomar cuidado para manter o embrião completamente submerso na solução de Ringer durante todo o procedimento para evitar a desidratação do tecido. Manter a adição de gotas de solução de Ringer para a superfície do embrião via pipeta de transferência, se necessário. </li><li> Usando uma agulha de vidro puxado, cuidadosamente fazer rostral e caUdal incisões transversal correspondente ao comprimento e região de interesse dentro do tubo neural dorsal. (Agulhas de vidro Puxado são gerados a partir de tubos capilares de vidro de silício que foram puxados sob calor com uma agulha de puxar aparelho.) Para enxertos unilaterais as incisões só deve estender-se ao lúmen do tubo neural dorsal, e para enxertos bilaterais, fazer as incisões através o tubo dorsal inteiro neural. Em seguida, corte a nível bilateral entre o tubo neural dorsal e do mesoderma paraxial. </li><li> Cuidadosamente separar o explante excisados ​​a partir do tubo neural em seguida, removê-lo a partir do embrião por aspiração em uma micropipeta de vidro (Figura 3B). </li></ol> 4. Prepare o tecido doador do enxerto <ol><li> Escolha um estágio combinado embrião de codorna. Segurar o embrião para baixo com uma pinça de AA, remover a membrana vitelina, e consumo de uma região semelhante do tamanho do tubo neural, tal como descrito acima (3,3-3,4) (Figura 3A&#39;-B &#39;). Dependendo das necessidades de sua experiência, esta região pode ser umregião complementar do hospedeiro tubo (pintainho) neural ou a partir de uma região diferente ao longo do eixo rostro-caudal. (NB: para maiores enxertos regionais, incluindo completos enxertos do tubo neural, os pesquisadores podem querer acrescentar uma digestão protease nesta etapa para remover todo o tecido aderente mesenquimal do tecido do doador antes do transplante No entanto, para pequenos enxertos dorsal do tubo neural em estágios iniciais. , como é descrito aqui, a digestão da protease não é necessária porque o tubo neural é facilmente separado do mesênquima adjacente por meio de técnicas estritamente cirúrgicos.) </li></ol> 5. Enxerto do tecido <ol><li> Aspirar o explante doador em uma micropipeta de vidro contendo a solução de Ringer. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas na pipeta. </li><li> Transferir o explante adjacente à região excisado do hospedeiro pinto. Usando agulha de vidro puxado, orientar o explante e suavemente guiá-la para a região ablacionada (Figura 3C). </li><li> Adicionar cuidadosamente algumas gotas de solução de Ringerpara o embrião para evitar a desidratação. Tome cuidado para evitar o descarte de líquidos diretamente sobre o local do enxerto, pois isso pode deslocar o enxerto. </li><li> Selar a janela com fita de embalagem. Certifique-se que a fita de vedação de toda a região do ovo de janela. Isto evita que a desidratação e contaminação do embrião durante a incubação subsequente. </li><li> Devolver o ovo para a incubadora até a fase desejada. Certifique-se que a função de &quot;balanço&quot; é desligado enquanto incubando as quimeras. Os ovos podem ser suavemente girado com a mão duas vezes por dia, pois isso pode aumentar a sua viabilidade se as fases posteriores do desenvolvimento são direcionados. </li></ol> 6. Preparar embriões quiméricos para o seccionamento <ol><li> No endpoint experimental, cortar a fita que cobre a janela usando tesoura fina. </li><li> Agarrar a borda da blastoderme com curvo íris pinça (mais fácil de fazer com serrilhada dicas), depois cortar o embrião para longe da gema com 4 cortes grandes fora dos limites da blastoderme. </li&gt; <li> Transferência do embrião para uma placa de Petri contendo solução de Ringer. Ter o cuidado de minimizar a exposição do embrião para o ar, a fim de evitar a desidratação do tecido. </li><li> Sob estereomicroscópio, separar delicadamente a membrana vitelina da blastoderme usando # 5 fórceps. </li><li> Cuidadosamente providenciar o embrião no prato de modo que o embrião está na mesma orientação como era o ovo, com membranas que rodeiam estabelecidos plana. </li><li> Use dissecando agulhas feitas a partir de 64 fios de tungsténio para remover o limpa blastoderme circundante a partir do embrião arranjando a agulha no limite do embrião e tecidos extra-embrionário, com o comprimento do fio de tungsténio paralelo ao fundo do prato. Use um movimento de corte suave para cortar os tecidos. </li><li> Retire cuidadosamente o âmnio com # 5 fórceps. Neste ponto, você pode, quer ou dissecar ainda mais a região de seu interesse, ou deixar todo o embrião. </li><li> Transferência do embrião para PARAF gelada 4%ormaldehyde e rocha durante a noite a 4 ° C. </li><li> Preparar amostras e incorporar para o seccionamento crio-ou parafina. </li></ol> Trace o tecido enxertado dentro do embrião hospedeiro. Existem várias técnicas para a identificação de tecido codorna dentro de um embrião de galinha, incluindo a detecção de codorna nucléolos pela coloração hematoxilina (núcleos de codorna têm muito grandes, de coloração mais escura do que inclusões núcleos pintinho), a reação de Feulgen-Rossenbeck, acridina-laranja ou biz-benzamida mancha combinado com microscopia eletrônica, ou imunomarcação com codornas antígenos específicos 3,47,65,66. Aqui usamos antígeno QCPN e todo padrão de montagem ou secção técnicas de imunofluorescência para identificar as células da crista neural de codorna em codorna-chick quimeras (Figura 4). Esta técnica fornece a maior flexibilidade no design experimental, como a imunofluorescência QCPN podem também ser combinados com outros anticorpos para identificar as células diferenciadas derivadas de tecido do dador (codornizes). Use Standard todo-mount ou técnicas de imunofluorescência seção para rotular codorna células derivadas de quimeras. 7. Os resultados representativos Uma imagem representativa da região enxertada do tubo neural após 6 horas de re-incubação (para HH11) mostra a incorporação esperada do dador de tecidos enxertados (codornizes) no hospedeiro (pintainho) do tubo neural (Figura 4A). Embriões demonstrando a integração incompleta do enxerto, ou desenvolvimento assimétrico da região craniana ou sómitos após reincubação deve ser descartado. Secção transversal através da região enxertado em HH11 CNCC mostram marcadas com HNK-1 migrar lateralmente para longe do tubo neural. Células de codorniz que contribuem para o fluxo de NCC migratório, e para o tubo neural, são claramente identificada com QCPN (Figura 4B). Em fases posteriores, codorna NCC células derivadas pode ser atribuída a seu tecido alvo final. As células marcadas são intercaladas QCPN dentro do mesênquima embrião de pintodo processo da maxila em E5 (Figura 4C). O anticorpo QCPN pode ser facilmente combinados com outros anticorpos para examinar a diferenciação de codorniz derivados CNCC no ambiente de acolhimento. Codorniz NCC-derivados trigeminais neurónios sensoriais são rotulados por QCPN e TUJ1 anticorpos (Figura 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> Figura 1. Resumo do procedimento experimental e instrumentos necessários. A Host) (pinto) e doadores (codorna) embriões deve ser palco correspondido. Para identificar o fluxo de NCC que contribui para o gânglio trigeminal e maxilo-mandibular região, HH9 é o ideal. No HH9, o tubo neural está começando a se fechar na região rostral, mas ainda não está completamente fechado. A linha de cinza nos diagramas representa a linha média do tubo de encerramento neural. As linhas pontilhadas brancas indicam as linhas de corte para excisar a região do mesencéfalo do lado direito do tubo neural do hospedeiro e doador inbryos. A região excisado do embrião hospedeiro é descartado eo tecido do doador transplantadas em gerar o embrião quimérico. B) instrumentos necessários incluem: uma seringa) 5mL com 18 ½ G agulha hipodérmica, b) uma seringa mL com 26 ½ G dobrado agulha hipodérmica a 45 ° nanquim ângulo, c), d) fita de embalagem clara, e) pipeta de vidro com a boca de pipetagem aparelho, f) 60 mm de prato Petri, g) AA fórceps, h) fórceps curvos íris com serrilhada dicas, i) # 5 pinças, tesouras finas j), k) aguçado fio de tungstênio, l) puxou o vidro de agulha, m) parafilme quadrados. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de óvulos e embriões. A) diagrama transversal do ovo, incluindo ponto de inserção ideal de 18 ½ G agulha hipodérmica para a retirada da luz de albumina. B) Após a retirada ~ 3 mL de albumina luz, a gema eo embrião dentro do ovo diminui, permitindo que os pesquisadores para cortar uma &quot;janela&quot; (setas) em tele casca de ovo para acessar o embrião. Nanquim, 1:10 diluídos em solução de Ringer estéril, podem então ser injectado por baixo da blastoderme para proporcionar contraste para teste fácil dos embriões. C) embrião de galinha depois de tinta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> Figura 3. Esquemática e exemplos de fase HH 9 embriões doador e do receptor em cada passo do processo miocárdio. A) embrião hospedeiro pintainho. As linhas tracejadas no diagrama indicam que a membrana vitelina que deveriam ser rasgadas para acessar a região craniana para enxertia. Uma vez dividido o retalho triangular de membrana vitelina deve ser descascado caudalmente. Box em imagem indica inset usado em (BC). A &#39;) Quail embrião doador. A imagem é de embrião doador excisado a partir de ovo e colocados em placas de Petri para dissecção do tecido do enxerto. Caixa na imagem indica inserção utilizado em (B &#39;). As linhas tracejadas em diagrama esquemático (A &#39;) indicar onde o vitelina e membranas de vitelo deve ser cortado, a fim de remover tele embrião do ovo. B) embrião hospedeiro com a região do mesencéfalo unilateral do tubo neural cortado (setas brancas) aguardando enxerto. Linha a tracejado na diagrama esquemático indica onde os cortes devem ser feitos para o tubo de consumo neural na região do mesencéfalo. Embrião B &quot;Dador), com enxerto de tecido neural dorsal tubo cortado (tecido enxerto indicado por setas pretas). Linha a tracejado na diagrama indica onde os cortes deve ser feita no embrião codornizes ao tecido do doador de consumo para unilateral enxertia da região do mesencéfalo do tubo neural. C) embrião quimérico após a enxertia de explante tubo neural dorsal codorna para a região do mesencéfalo pintinho. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> Figura 4. Imunofluorescência detectar codorna específico QCPN antígeno nuclear em células derivadas de doadores no embrião quimérico. A) imagem inteira de montagem de HH11 quimera (enxertados em HH9) mostrando coloração QCPN em vermelho, e HNK-1 coloração (um marcador de migração CNCC) emverde. Aumento de 10x, vista dorsal. B) Corte transversal através de embriões em (A), mostrando células QCPN-positivas codornizes derivados no tubo neural e NCC migratória co-coradas com HNK-1 (verde). Aumento de 40 vezes. C) Corte transversal através de um processo maxilar de E5 quimera (incubadas durante 3 dias pós enxerto), mostrando QCPN-positivas NCC células derivadas (vermelho) que migraram a partir da região enxertada do tubo neural para a sua localização final no embrião. Aumento de 10x. D Secção) através E5 contribuição quimera mostrando de codorna derivado NCC para o gânglio trigêmeo (vermelho) e diferenciação em neurônios TUJ1-positivos (verde). Aumento de 40 vezes. *, NCC; MP, processo maxilar; NT, tubo neural; gânglio, TG trigêmeo.

Os autores não têm nada a revelar.

O enxerto de tubo neural em embriões de galinha codorna acolhimento descrito aqui é uma técnica simples e barata para rastreamento subpopulações específicas de migração CNCC provenientes de diferentes regiões ao longo do eixo rostro-caudal 21,67-69. Esta técnica tira vantagem da facilidade de acesso para embriões aviários (em comparação com os embriões de mamíferos) e pode ser combinada com outras técnicas, tais como a ablação do tecido, a injecção de moléculas inibidoras, ou através de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Ovos Chick </td><td> Vários - usamos Texas A &amp; M University Poultry Science Department, TX. </td><td></td></tr><tr><td> Ovos de codorna </td><td> Vários - usamos Ozarks Empresa Egg, MO. </td><td></td></tr><tr><td> Ovo incubadora (Digital Leitura 1502 Sportsman Incubadora w / Umidade 110-120 V CA) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> Dumont AA fórceps, Inox revestido de epóxi </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> Fita adesiva </td><td> Qualquer loja de material de escritório </td><td></td></tr><tr><td> Curvo Iris fórceps </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> Eundia tinta </td><td> Qualquer loja de material de arte </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep Solution (penicilina, estreptomicina) </td><td> VWR International </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> A fita de embalagem clara </td><td> Qualquer loja de material de escritório </td><td></td></tr><tr><td> Agulha aparelho puxando </td><td> Narashige, Japão </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> Agulha de vidro puxado, fez 1,5-1,8 tubo de vidro de borosilicato x 100mm capilar </td><td> Kimble perseguição </td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> Puxado vidro pipeta, feita a partir de 5 ¾ &quot;pipeta Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td></tr><tr><td> Aparelho de boca pipeta (tubo de aspirador de montagem para pipeta calibrada microcapilar) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> Tonelarame gsten, diâmetro 0,1 milímetros </td><td> VWR International </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> Porta-agulhas (Niquelado titular pinos) </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN anti-soro </td><td> Desenvolvimento de Estudos Hybridoma Bank, da Universidade de Iowa </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> Alexa anticorpo Fluor secundário (por exemplo, Alexa Fluor 594 cabra anti-rato IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> Solução de Ringer (2L): <ul><li> 14,4 g de NaCl </li><li> 0,34 g de CaCl2 </li><li> 0,74 g de KCl </li><li> 0.230g de Na 2 HPO 4 </li><li> 0,04 g KH 2 PO 4 </li><li> ddH2O para 2L </li><li> Filtro e autoclave </li></ul></td><td> Todos os reagentes de Fisher Scientific </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

analysis of neural crest migration and differentiation by cross-species transplantation

Embriões de aves fornecer uma plataforma única para o estudo de muitos vertebrados processos de desenvolvimento, devido ao fácil acesso dos embriões dentro do ovo. Quiméricos embriões aviários, em que as codornizes tecido do dador é transplantado para um embrião de pinto in ovo, combinam o poder de rotulagem genética indelével de populações de células com a facilidade de manipulação apresentada pela embrião aviário. Quail chick-quimeras são uma ferramenta clássica para a detecção migratórias células da crista neural (CNCC) 1-3. CNCC são uma população transitória migratório das células do embrião, que se originam na região dorsal do tubo 4 desenvolvimento neural. Eles sofrem uma transição epitelial para mesenquimal e, posteriormente, migrar para outras regiões do embrião, onde se diferenciam em vários tipos celulares, incluindo cartilagem 5-13, melanócitos 11,14-20, neurônios e células gliais 21-32. CNCC são multipotentes, e seu destino final é influenciadoinfluenciada por 1) a região do tubo neural em que são originários ao longo do eixo rostro-caudal do embrião 11,33-37, 2) sinais de células vizinhas à medida que migram 38-44, e 3) o microambiente do seu final destino dentro do embrião 45,46. Rastreamento essas células a partir de seu ponto de origem no tubo neural, a sua posição final e destino dentro do embrião, fornece informação importante sobre os processos de desenvolvimento que regulam a padronização e organogênese. Transplante de regiões complementares de tubo neural doador (homotópico do miocárdio) ou diferentes regiões do tubo neural do doador (enxerto heterotópico) pode revelar diferenças de especificação pré-CNCC ao longo do eixo rostro-caudal 2,47. Esta técnica pode ser ainda adaptado para transplantar um compartimento unilateral do tubo neural, tal que um lado é derivado a partir de tecido do dador, e os restos lado contralateral não perturbada no embrião hospedeiro, yielding um controle interno, dentro da mesma amostra 2,47. Ele também pode ser adaptado para o transplante de segmentos cerebrais em embriões mais tarde, após HH10, quando o tubo neural anterior foi fechada 47. Relatamos aqui técnicas para a geração de codorniz chick-quimeras por transplantação tubo neural, que permitem a detecção de CNCC migratórios derivados a partir de um segmento discreta do tubo neural. Específica da espécie rotulagem das células derivadas de dador com o anticorpo QCPN codorniz-específica 48-56 permite que o pesquisador para distinguir dador e células hospedeiras no ponto final experimental. Esta técnica é simples, barato, e tem muitas aplicações, incluindo mapeamento de destino, a linhagem celular de rastreamento, identificação e padronização de pré-eventos ao longo do eixo rostro-caudal 45. Devido à facilidade de acesso para o embrião aviário, a técnica de enxerto codorniz-chick pode ser combinada com outras manipulações, incluindo mas não limitado a ablação da lente 40, a injecção de moléculas inibidoras 57,58, ou manipulação genética através de electroporação de plasmídeos de expressão 59-61, para identificar a resposta de determinados fluxos migratórias de CNCC a perturbações no programa de desenvolvimento do embrião. Além disso, esta técnica de enxerto pode também ser usado para gerar outros embriões interespecíficos quiméricos, tais como codorniz-pato quimeras para estudar NCC contribuição para a morfogénese craniofacial, ou rato chick-quimeras para combinar o poder de rato genética com a facilidade de manipulação do embrião aviário 62.

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Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.

Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.7K visualizações.  Rice University. Uma abordagem para análise da migração e destino final dos aviários células da crista neural em codornas de-bico embriões quiméricos é descrito. Este método é uma técnica simples e direta para rastrear células da crista neural durante a migração e diferenciação que são de outra maneira difícil distinguir dentro de um embrião de galinha não-manipulado.

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Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Neurociência

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Um ensaio de migração celular quantitativo para murinos progenitores neurais entéricas

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...