研究では、NSF賞MCB-1021384によってサポートされています。

1。嫌気性バッファーの調製<ol><li> 100mMリン酸カリウム緩衝液1 L、pHが7.5を準備します。攪拌棒を500 mLのブフナーフラスコにバッファー250mLのを注ぐ。 </li><li>ゴム栓とフラスコを密封し、攪拌プレート上に置きます。シュレンクラインにフラスコの短いチューブを接続します。 </li><li>ドガ攪拌しながら室温で5時間真空下でのバッファ。この期間中、毎時間脱気し、アルゴンでフラッシング真空の5つの連続した​​ラウンドを実行します。 </li><li> 10秒間のアルゴンとフラスコをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内にフラスコを置きます。 </li><li>激しく攪拌しながら一晩グローブボックス内でフラスコを開いたままにします。 </li></ol> 2。ストップトフローシステムから酸素を除去する<ol><li> 0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0の1リットルを準備します。 250mLのブフナーフラスコに、このバッファ125 mLを注ぎ、ステップ1.2から1.4を実行します。 </li><li> 5を秤量アスペルギルスニジェール （181300 U / g）と0.9グラムのグルコース1.5mlのエッペンドルフチューブと50mlのファルコンコニカルチューブを使用して、それぞれからmgのグルコースオキシダーゼ。グローブボックスに両方のコンテナを配置します。 </li><li>嫌気性0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0（それぞれ18.13 U / mLと100 mMの、最終濃度）の50 mLのグルコースオキシダーゼとグルコースを溶解する。この溶液（ 図1）貯水池シリンジを満たします。 </li><li>ドライブのバルブは&quot;負荷&quot;の位置にあることを確認し、ドライブのシリンジ（ 図1）を記入してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロデータコントロールソフトウェアで空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。このステップの合計で10回繰り返します。他の3つのドライブシリンジと同じ手順を実行します。一時間待ちます。 </li><li>同じバッファcontaiとリザーバーシリンジのソリューションを置き換えるグルコースオキシダーゼとグルコース寧。手順2.4を繰り返します。 </li><li>手順2.5を繰り返し、解決策は一晩フローシステムに立つことができます。 </li><li>一晩インキュベートした後、手順2.5を繰り返します。 </li></ol> 3。酸素飽和バッファーの調製<ol><li> 100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を調製し、攪拌棒を50-mLバイアルに50mLを注ぎます。ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ。 </li><li>氷の上でバイアルを置きます。溶液中に100％の酸素を含むタンクに接続されて長い針を浸します。ベントとして、バイアルの栓を介して別の短い針を挿入します。 </li><li>泡攪拌しながら1時間100％の酸素とソリューションを提供します。 </li><li>最初のバイアルから短い針を除去し、長い針を取り外す前に、10秒待ちます。グローブボックス内で閉じたバイアルを置きます。 </li></ol> 4。 NADPH溶液の調製<ol><li> 1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにNADPH 1mgを秤量し、iを置くグローブボックスにトン。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）300μLでNADPHを溶かす。分光光度計（ε340 nmの = 6270 M -1 cm -1を ）とNADPH濃度を決定するためにグローブボックスから、この溶液の30μLを削除します。 </li></ol> 5。酵素溶液からの酸素の除去<ol><li>グローブボックス内の冷凍庫で、解凍から酵素ストック溶液400μLを取る。酵素原液（360μM）は、以前に100mM NaClを含む100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）で調製し、液体窒素中で凍結させた。 </li><li>攪拌棒25 mLバイアル中に酵素溶液を移し、ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ、グローブボックスから削除します。 </li><li>氷の上でバイアルを置き、バイアルの栓に針を挿入することによって、シュレンクラインに接続します。 </li><li>ドガの連続した​​5ラウンドを行うことにより、酵素溶液1時間ごとに20分を脱気し、アルゴンでフラッシング真空。 </li><li> 10秒間アルゴンバイアルをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内の氷の上に瓶を置きます。 </li></ol> 6。還元的半反応：監視フラビン還元<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、単​​一の混合モードでのストップトフロー測定器とPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 </li><li>循環水浴（15℃）をオンにします。 20分間それを通して窒素をバブリングすることにより水から酸素を除去します。これは、フロー回路を介して酸素の混入を防ぐことができます。 </li><li>循環浴にストップトフローの水浴ハウジングを接続することにより、ドライブシリンジの温度と15の観測セル°Cを維持しています。 </li><li>プロのデータの制御ソフトウェアを選択してフォトダイオードアレイ、外部トリガ（ストップトフローの動作をアクティブにする）、およびLogaritの[コントロールパネル]ウィンドウでHMIC規模。 </li><li>プロのデータビューアソフトウェアを起動し、データファイルが格納されるディレクトリを定義します。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）と貯水池シリンジCとFのソリューションに置き換えます。 &quot;ドライブ&quot;の位置にCとFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で（RAMのそれぞれの動きの前に空にするをクリックします）、合計で5回、対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジの両方からのバッファを押してください。 </li><li>そのグルコースオキシダーゼが流れ回路から完全に削除されていることを確認するためには、合計で6.6の4倍をステップ実行します。 </li><li>プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1100μLに酵素原液の100μLを混和します。 </li><li>貯水池SYRのソリューションを置き換える酵素溶液とFをインゲ。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFから酵素液をプッシュします。合計で、この三回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、60秒に取得時間を設定します。 </li><li>両方のドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置に両方のバルブを回して、ドライブを実行するためにプロのデータ制御ソフトウェアの取得]をクリックします 。三重内のデータを取得するために2倍以上、この手順を繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 </li><li>ドライブから得られた452 nmの値を使用して、（ε452 NM = 13700 M -1 cm -1）を混合する前に酵素濃度を決定し、NADPH solutio 4 mLの準備を■1.5倍以上濃縮した。 </li><li> 6.10で説明したようにNADPH溶液と空の補充停止シリンジで3回リザーバーシリンジCの溶液を交換してください。 </li><li>ステップ6.11を繰り返します。酵素の減少時にこの収量スペクトルを示す。 </li></ol> 7。酸化半反応：監視フラビンの酸化<ol><li>ストップトフロー測定器および製造業者のプロトコルに従って、ダブルミキシング·モードのPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 </li><li>ステップ6.2から6.5を繰り返します。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を持つ4つのリザーバーシリンジ内の溶液を交換してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。各ドライブシリンジとの合計でこのステップを5回実行します。 </li><li> TOTには7.3の4倍をステップ実行します。らは、完全に流れ回路からコンテンツを削除します。 </li><li>プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします 。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1000μLに酵素原液の200μLを混和します。 </li><li>酵素溶液をリザーバーシリンジのソリューションに置き換えます。 &quot;ドライブ&quot;の位置にバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって、ドライブシリンジから流れ回路を介して酵素溶液をプッシュします。このステップを合計3回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、0.5秒の遅延時間と60秒の取得時間を設定します。 </li><li>すべてのドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にすべてのバルブを回しとPro-DATの取得をクリックしますドライブを実行する制御ソフトウェア。三重内のデータを取得するためにこのステップを2回以上繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 </li><li>注射器Aの酵素溶液 &quot;ドライブ&quot;の位置と空の補充停止注射器のように7.7で説明されて三回にBバルブを回して、1.5倍より濃縮されたNADPH溶液とリザーバーシリンジBの溶液を交換してください。 </li><li>酸素バッファを持つ貯水池注射器Cの溶液を交換してください。ストップシリンジに7.7で説明したように三回の &quot;ドライブ&quot;の位置と空にCのバルブを回して補充。プロのデータの制御ソフトウェアでは、それぞれ、15、900秒での遅延と取得時間を設定します。 </li><li>手順7.8を繰り返します。完全に減少し、酵素の再酸化の間にこの収量スペクトルを示す。 </li></ol> 8。データ解析<ol><li>プロのデータコンバータソフトを起動します。 オプションアイコンをクリックするとProDataCSVに保存]を選択します。 </li><li>開くデータファイルが格納されていたディレクトリにコピーします。 APLプロのデータコンバータのウィンドウにファイルをドラッグします。データは同じディレクトリ内のCSV形式ファイルとして自動的に保存されます。 </li><li>をMicrosoft Excel（マイクロソフト、レッドモンド、ワシントン州、米国）を使用してCSV形式のファイルを開きます。 700 nmで対応する吸収を差し引くことによってストップトフロー·トレースのベースラインを正規化します。 </li><li>適切な指数関数に対応する最大時間に対する吸光度のプロットをフィッティングすることにより、カレイダグラフ（Synergyソフトウェア、読書、PA）を用いて補正トレースを分析する。 図2Bに示すように、452 nmの吸光度をストップトフロー装置内酵素およびNADPHを混合した後、フラビンの削減率を決定するために、時間の関数としてプロットした。この場合、データのベストフィットは、還元、resの第1および第2の位相を計算した二重指数関数方程式と0.65と0.23 s -1の速度を用いて得られたpectively。 C4A-hydroperoxyflavin中間体の形成の速度と酸素が ​​減少する酵素を反応させた後、再酸化を決定するために、我々は、それぞれ380および452 nmであり、（ 図3B）で停止したフローのトレースを分析した。単一の指数関数の式を使用して、我々は、それぞれ、酸化半反応の第一および第二のステップで1.4と0.006 s -1の速度を算出した。 </li></ol> 9。代表的な結果前のセクションで説明した実験結果からは、fキンゴジカの還元の半反応はフラビンの酸化還元状態の変化に対応する452 nmの吸光度の変化を測定することにより監視することができる方法を示しています。このステップの速度は、適切な式（;ステップ8.4 図2）にデータをフィッティングすることにより決定することができます。得られた削減率（0.65秒-1）と計算されたk個の猫値に似ています還元反応の律速段階であることを示唆している定常状態の実験2。ストップトフローのダブルミキシング·モードを活用して、酸化し、この半反応における中間体の速度が（;ステップ8.4 図3）決定することができます。 Fキンゴジカによって触媒される反応では、C4A-hydroperoxyflavinは明らかに（380nmのλmax）で検出され、形成と崩壊の速度を計算することができます。得られた再酸化（0.006秒-1）の遅い速度は、C4A-hydroperoxyflavinが存在しない場合にオルニチン非常に安定であることを示します。 <img alt="スキーム1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> スキーム1。Fキンゴジカのメカニズム。 FAD補のisoallozaxineリングが表示されます。酸化フラビン（）は、NADPH（B）に結合してフラビンとNADP +（C）を還元型に反応します。酸素分子との結合との反応後オルニチン、C4A-hydroperoxyflavin（D）が形成される。これは、ヒドロキシル化種である。オルニチンの水酸化の後、hydroxyflavin（E）は、酸化酵素を形成するために脱水する必要があります。 NADP +は、触媒サイクルを通して結合したままで、（F）をリリースする最後の製品です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> 図1ストップトフロー測定器。 A）応用光物性SX20のコンポーネントの写真ストップトフロー分光光度計を。サンプルハンドリングユニットのB）画像。ダブルミキシング·モードでのフロー回路のC）スキーム。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> 図2。ストップトフロー測定器でNADPHとキンゴジカの嫌気性減少。 30μMと45μMキンゴジカのNADPHの等量を混合した後に記録された）スペクトルの変化。第一スペクトル（酸化SIDA）と最後のスペクトル（完全に削減シド）は、それぞれ青と赤で強調表示されます。 B）の吸光度は時間の関数として記録された452 nmでトレースします。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> ストップトフロー測定器でキンゴジカの図3。酸化。 A）スペクトルの変化は完全に低下しキンゴジカと酸素バッファの等量を混合した後に記録されます。最終濃度は15μMSIDA、22.5μMのNADPH、および0.95 mMの酸素であった。スペクトルは、0.034、4.268で記録され、727.494 sは、それぞれ完全に減少する酵素、C4A-hydroperoxyflavin中間体（380nmのλmax）、および酸化酵素（450nmのλmax）に対応しています。 B）382及び452 nmでの吸光度トレースは時間の関数として記録されます。

<ol>
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我々は、開示することは何もありません。

酸化還元反応を触媒する酵素は、通常、触媒サイクルの間に有意な吸光度の変化がヘムとフラビンなどの補因子が含まれています。フラビンの酸化型では、〜360と450nmの吸光度の最大値を示し、その減少は一般的に450 nmの7での吸光度の減少に従うことによって監視されています。一般的には、いくつかの一時的な中間体は存在するが、通常の分光光度計で測定される形と減衰が速すぎです。応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計（または類似の楽器）を使用して、それはミリ秒の時間スケールでの吸光度の変化を（デッドタイム、2ミリ秒）を測定することが可能です。ここでは、モデルとして、フラビン依存性モノオキシゲナーゼFキンゴジカの還元的および酸化的半反応を調べた。水素化物の転送速度は、嫌気的条件下でNADPHと酵素を混合した後、452 nmでの吸光度の変化を測定することにより決定した。その後、advantagを取る完全な削減が達成されるまでストップトフロー装置の二重混合モードのE、酵素は、まず減少し、酵素NADP +複合体は酸素と混合し、NADPHと反応させた。この手順に続いて、それは一時的な酸素フラビン中間体を検出するための形成と崩壊の速度を測定することが可能です。これらの中間体の同定は、触媒の反応種の性質についての実験データを提供します。 F SIDA、ヒドロキシル種であるC4A-hydroperoxyflavin（通常は370から380 nmでモニター）の形成の場合である。さらに、各ステップの速度定数を測定すると、1つは、反応の律速段階に関する情報を取得し、酵素の速度論的および化学的メカニズムを解明するのに役立つことができます。 一般的には、同様のアプローチは、他のflavoenzymes、またはそのようなCONTそのタンパク質などの吸光度の変化が発生したタンパク質は、使用することができAINヘム、ピリドキサール、リン酸、または非ヘム鉄8-10このメソッドへの制限は、精製酵素の大量が必要であることですが、これは高収率で発現系を用いることにより克服することができます。一つは、十分に強い信号が観測できるように十分なタンパク質を使用して記録スペクトルの最適なタンパク質濃度を決定するではなく、多すぎるように酵素が浪費されていません。一般的に、ストップトフロー実験に使用したフラビン含有酵素の最も低い酵素濃度は6-10μM（混合した後）であり、酵素の対応するモル吸光係数を用いて決定される。 Fキンゴジカの場合には、酵素結合したFADの割合は50から65パーセント2です。バインドされたFAD補因子が触媒作用に必要となりますので、アポ蛋白質は、これらの実験では非アクティブと見なされます。このメソッドへのもう一つの可能​​性の制限は、酵素のプロセスは、彼らが観察されることはありません2ミリ秒（ストップトフローのデッドタイム）よりも速いが発生した場合ですが、目EREは、レートは、この問題を克服するために減少させることができる戦略を報告されています。このための一つの例は、フェレドキシン-NADP +還元酵素11の反応で、高NaCl濃度を使用して含まれています。ストップトフローの流路からの酸素のスクラブは、多くの場合、この実験ではトリッキーなステップであり、特別な注意が必要です。それが効果的かつ安価な方法としてここで説明したグルコースオキシダーゼグルコースシステムは、ほとんどの研究室で正常に使用されています。しかしながら、H 2 O 2の産生を含め、いくつかのアプリケーションのためprotocatechuateオキシゲナーゼ-protocatechuateシステムなど、他の選択肢が12考慮すべきいくつかの欠点があります。嫌気性グローブボックスの利用は、簡単に嫌気的条件を確保することができるが、必須ではありません。我々は酵素は酸素の存在下で減少する場合や、濃度の酸素と反応し、酸素が停止してフローの流路から除去しなければならない我々は指定されたの。ストップトフローは、グローブボックス内でですが、我々は以前の実験で好気性のバッファを使用した場合、酸素が流れ回路である。吸光度測定に加えて、蛍光および円偏光二色性アッセイは、対応するアクセサリと応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計で行うことができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 一般的な実験装置 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ウェルチ</td><td> - </td></tr><tr><td>ブフナーフラスコ</td><td>フィッシャー</td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td>棒をかき混ぜる</td><td>フィッシャー</td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td>プレートをかき混ぜる</td><td>フィッシャー</td><td> 11から100-49S </td></tr><tr><td>シュレンク行</td><td> Kontesグラス</td><td> - </td></tr><tr><td>アルゴンタンク</td><td> Airgasの</td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td>窒素タンク</td><td> Airgasの</td><td> NI200 </td></tr><tr><td>窒素タンク、超高純度グレード</td><td> Airgasの</td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td> Airgasの</td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5％の水素バランス窒素タンク</td><td> Airgasの</td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20セントoppedフロー分光光度計</td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td>グローブボックス</td><td>遠慮がちな</td><td> - </td></tr><tr><td>水浴</td><td>ブリンクマンラウダ</td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 用品 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mLのBDファルコンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mLのBDファルコンコニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td>の1.5 mLエッペンドルフ微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50および25mLのガラスバイアル</td><td>フィッシャー</td><td> 06から402 </td></tr><tr><td>ゴム栓</td><td>フィッシャー</td><td> 06-447H </td></tr><tr><td>アルミシール</td><td>フィッシャー</td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ReagenTS </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基</td><td>フィッシャー</td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td>リン酸カリウム、二塩基性</td><td>フィッシャー</td><td> P288-500 </td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A.からのグルコースオキシダーゼニジェール </td><td>シグマ</td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>フィッシャー</td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td>フィッシャー</td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L（+）-オルニチン塩酸塩</td><td>フィッシャー</td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

アスペルギルスシデロフォアA（SIDA）が（例えばferricrocinまたはN &#39;、N &quot;、N&#39;&#39;&#39; - triacetylfusarinine C）1病原性に必須であるヒドロキシデロフォアの生合成にオルニチンのヒドロキシル化を触媒するFAD含有モノオキシゲナーゼである。キンゴジカによって触媒される反応は、還元と酸化の半反応（スキーム1）に分割することができます。半反応の還元では、fキンゴジカにバインドされた酸化FADは、NADPH 2,3削減されます。酸化半反応では、 、還元型補因子は、オルニチンに酸素原子を転送C4A-hydroperoxyflavin中間体を形成し、分子状​​酸素と反応します。ここでは、速度を測定し、にインストールされているストップトフロー装置を用いてキンゴジカの異なるスペクトルフォームを検出するための手順について説明します。嫌気性グローブボックス。ストップトフロー装置では、反応物の少量が急速に混合され、流れた後、目によって停止されeは注射器（ 図1）を停止し 、観測セル内に配置ソリューションのスペクトルの変化を経時的に記録されます。実験の最初の部分では、我々はNADPHによるfキンゴジカにおけるフラビンの嫌気性低下が直接測定された単一モードでストップトフロー測定器を使用する方法を示しています。次にfをキンゴジカが最初に嫌気的に高齢化、ループ内での時間指定されている期間内においてNADPH削減され、ダブルミキシング設定を使用して、観察細胞（ 図1）分子状酸素と反応した。還元的半反応が監視されている場合にのみ、ソリューション内の任意の酸素が減少しフラビン補因子と反応して最終的に酸化されたフラビンに戻って減衰しますC4A-hydroperoxyflavin中間体を形成するので、この実験を実行するために、嫌気性のバッファが必要です。 ENZの完全なターンオーバーがあるだろうので、これは、ユーザーが正確に縮小率を測定することができませんでしたYME。還元と酸化の間にちょうどステップが観察されるように、酸化半反応が検討されているときにこの酵素は酸素の存在下で還元される必要があります。この実験で使用されるバッファの1つは、我々は、酸素の高濃度で酸化半反応を調べることができる飽和酸素である。これらは、しばしば手続きであるフラビン含有モノオキシゲナーゼとの還元または酸化半反応のいずれかを勉強したときに実施した。ストップトフローで実行前の定常状態の実験の時間スケールは、固有の速度定数の決定と反応4の中間体の検出および同定を可能にする秒、ミリ秒です。ここで説明する手順は、他のフラビン依存性モノオキシゲナーゼに適用することができます。5,6

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Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述<em&gt;アスペルギルス</em&gt;シデロフォアA（SIDA）、フラビン依存性モノオキシゲナーゼ。次にキンゴジカの反応の種に対応するスペクトルを示し、我々はそれらの形成のための速度定数を計算します。

ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

monitoring-reductive-oxidative-half-reactions-flavin-dependent

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K ビュー.  Virginia Polytechnic Institute and State University. 我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述アスペルギルスシデロフォアA（SIDA）、フラビン依存性モノオキシゲナーゼ。次にキンゴジカの反応の種に対応するスペクトルを示し、我々はそれらの形成のための速度定数を計算します。

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

生物工学

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the arterial wall lead to tissue injury, which initiates restenosis2-7. This hypothesis needs further investigations including better quantifications of non-uniform strain distribution on the artery following stent implantation. A non-contact surface strain measurement method for the stented artery is presented in this work. ARAMIS stereo optical surface strain measurement system uses two optical high speed cameras to capture the motion of each reference point, and resolve three dimensional strains over the deforming surface8,9. As a mesh stent is deployed into a latex vessel with a random contrasting pattern sprayed or drawn on its outer surface, the surface strain is recorded at every instant of the deformation. The calculated strain distributions can then be used to understand the local lesion response, validate the computational models, and formulate hypotheses for further in vivo study.

Stent-induced arterial strain distributions are characterized using an optical surface strain measurement system. This visualization technique is used to gain insights into the impact of stent implantation on the host vessel.

容器内ステントの展開中の壁の力学を監視する

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

遺伝的にコードされたFRETベースの胆汁酸センサを用いた細胞内胆汁酸動態のリアルタイムモニタリング

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

高速カメラによる高速マイクロバブルのイメージングと定量化

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.