この方法は、流体の流れが真菌バイオフィルムの成長と発達をどのように変化させるかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、リアルタイムでのバイオフィルムの成長と開発に対する流れの影響を定量的に評価できることです。テキストプロトコルに記載されているように、フロー装置の組み立てからこの実験を開始する。
実験の日は、バブルトラップ、温度プローブ、およびすべての単一使用部品を取り付けます。フィルターを組み立てるには、1 ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外してアダプターにします。フィルターボトルからこの端にチューブを無理に取り付け、成長フラスコにつながるチューブに2ミクロンフィルターを取り付けます。
スライドアダプタのバーブの周りにシリコーン真空グリースを塗布して接続します。100ミリリットルのYPDで付着フラスコを充填し、成長フラスコに200ミリリットルのYPDを充填します。緑の側のチューブが各フラスコのメディアに届くよう確認します。
すべてのバルブが開いていることを確認します。バブルトラップを真空に取り付け、ポンプをバブルトラップの下流にある緑の側のチューブに接続します。1分間に3.3ミリリットルの流量で流体をポンプで送り、グリーン側を完全に満たします。
次に、最初の数ミリリットルが死んだ細胞またはランダムな破片を含むことが多いため、培地の約1〜2ミリリットルを分配して廃棄する。先に進む前に、チューブの緑色の側がメディアで満たされ、バブルトラップの下流に泡がないことを確認してください。チャネルスライドとリザーバをYPDで満たし、気泡を導入しないように注意してください。
スライドをフロー装置に接続します。その後、オレンジ側に約5メートルのバッファを作成するために、より多くの流体をポンプ。これは、バックフローが発生した場合にスライド内の空気を誤ってトラップすることを防ぐためです。
ここで、まず気泡トラップの入口と出口を閉じて植えて顕微鏡に搬送するための流量装置を用意する。次に、緑とオレンジの側面の取り付けフラスコバルブを閉じます。脈動ダンパーとフィルターボトルのネジキャップが、自動めっき中に緩む可能性があるため、しっかりと固定されていることを確認します。
輸送を容易にするためにチューブからポンプを取り外します。次に、ホットプレートスターラーを含むすべてのコンポーネントを顕微鏡の近くの二次容器に移動します。温度プローブをホットプレートスターラーに取り付け、付着フラスコを摂氏37度に加熱し始めます。
300 RPM でメディアをかき混ぜ、実験全体のためにこれを維持します。スライドを顕微鏡に取り付け、必要に応じてテープを使用してしっかりと固定します。その後、バキュームにバブルトラップを取り付けます。
ここで、ポンプを流動装置に接続します。1分間に3.3ミリリットルの流量でポンプを始動させ、約5〜10秒間動かします。その後、手入れのふたの一族でバブルトラップを取り除きます。
取り付けフラスコがヒートアップしている間、ポンプの実行を継続させます。付着フラスコとインキュベーションチャンバーの両方が摂氏37度になったら、1ミリリットル当たり100万個の細胞に達するのに十分な一晩の真菌細胞の培養を付着フラスコに加える。細胞が順応できるように15分待ちます。
緑色とオレンジの側面の両方の取り付けフラスコバルブを開き、両方の成長フラスコバルブを閉じて細胞の流れを開始します。セルがスライドに到達するまで約 5 分間待ちます。この間、顕微鏡を焦点を合わせ、前の実験で使用したのと同じイメージングパラメータに調整します。
添付フェーズのイメージ取得を開始します。約 5 分と 10 分後に再度確認して、フォーカスが維持されていることを確認します。取得していない場合は、次の画像が取得された直後にフォーカスを調整します。
添付ファイルのフェーズが終了した直後に、ファイルを保存します。次に、両方のアタッチメントフラスコバルブを閉じながら、緑とオレンジ側の成長フラスコバルブの両方を開きます。インキュベーションチャンバー内にバルブがある場合は、ステージをぶつけないように注意してください。
温度計プローブを抜き、付着フラスコを成長フラスコに交換します。次に、22 時間にわたって 15 分ごとにイメージを取得し、成長フェーズのイメージ取得を開始するようにソフトウェアを構成します。成長相の取得が完了し、ファイルが保存されたら、オレンジ側の圧力が放出されると音を立てる可能性のある緑色とオレンジの側面アタッチメントフラスコバルブを開きます。
メディアの上に少なくとも数センチメートルになるまで、両方のメディアフラスコから来る緑の側面のチューブを引き上げます。次に、ポンプを高速で実行してチューブからすべてのメディアを取り除き、洗浄がはるかに簡単になります。最後に、テキスト プロトコルで説明されているビデオを定量化します。
この時間経過暗視野顕微鏡ビデオは、取り付け段階の間に野生型カンディダ・アルビカン細胞を基質アンダーフローに取り付け、その後の成長および成長過程での増殖および発生をバイオフィルム形成に導く様子を示す。これらのビデオからのデータは、時間の経過に伴う細胞の取り付けおよび剥離およびバイオマスの割合について分析することができ、ここに示されているのは、密度測定分析によって決定される画像領域内の総バイオマスである。時間経過に関する細胞の添付ファイルの累積率とバイオマス剥離率も示されています。
この手順を試みる間は、すべての実験で同じイメージング条件を使用することが重要です。
