小型の原形質膜分離プロトコルとmGFPHisダブルタグは、真核生物の膜タンパク質を特徴付けるための経済的、迅速で信頼性の高い、簡単な方法、サッカロミセスセレビシエを提供します。この技術の最大の利点は、膜タンパク質発現レベル、ATPの活性および洗剤が精製に最も適している容易さと速度が決定できることです。この技術は非常にユーザーフレンドリーです。
しかし、覚えておくべきことの1つは、細胞を2のOD 600として収穫し、ミトコンドリアの汚染が少なく、可能な限り最高のATPase活動を保証することです。1分間に200回転で7〜8時間摂氏30度で10ミリリットルのYPD培地で単一の酵母コロニーを前培養することから始めます。新鮮なYPD培地の40ミリリットルを接種するためにプレ培養の10ミリリットルを使用してください。
その後、細胞密度が1〜3のOD 600に達するまで、毎分200回転で一晩摂氏30度で細胞をインキュベートします。翌日には、4度で遠心分離機で対数顔細胞の40の光学密度単位(ODU)を収穫し、摂氏4度で5分あたり200倍G。40ミリリットルの氷冷滅菌二重蒸留水で細胞を再中断して洗浄します。
洗浄工程の間に遠心水で1ミリリットルの氷冷水を使用して洗浄を繰り返します。氷冷滅水の1ミリリットルにペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を氷上で予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。セルを摂氏4度で3分間300倍Gで収穫する。
上清を吸引し、500マイクロリットルの均質化バッファーで細胞ペレットを再懸濁し、1ミリモルフェナルメチルスルファニールフッ化物、またはPMSFを補充した。さらに使用するまで、セル懸濁液をマイナス80°Cで保管してください。氷上の細胞を約1時間解凍します。
その後、氷冷0.5ミリメートル直径シリカビーズを細胞懸濁液の500マイクロリットルに加え、1ミリリットルの総体積に達する。細胞を破壊するために、細胞懸濁液を最大揺れ強度で1分間、6サイクル、各サイクルに続く氷上で3分間の冷却期間を有する。ボルテックス後、加熱されたメスブレードでチューブの底に薄い穴を作り、壊れた細胞ホモジュネートを別の氷冷1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに集め、低速スピンを10秒間行います。
採取した細胞を5、156倍のGで遠心分離し、4°Cで5分間Gをホモジュし、細胞の破片を取り除く。450マイクロリットルの上清を氷冷1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、1ミリモル新鮮PMSFを補った氷冷均質化バッファーを1ミリリットル加えます。細胞懸濁液を17、968倍Gで摂氏4度で1時間、遠心分離した形質膜を収穫する。
上清を取り除き、1ミリモルPMSFで補充したての均質化バッファーの100マイクロリットルを追加します。その後、100マイクロリットルピペットチップで攪拌して形質膜ペレットを緩め、ピペットを上下に繰り返してペレットを再懸濁します。還元剤と洗剤を含むバッファーと互換性のあるタンパク質アッセイキットを用いて、血漿膜調製物のタンパク質濃度を測定します。
血漿膜をマイナス80度で保存するか、氷の上に保管してすぐに使用してください。組み立てられたゲル装置に4~5ミリリットルの分離ゲルを上から2センチメートルまで注ぎます。慎重に上に0.1%SDSの1〜2ミリリットルを重ね、ポリアクリルアミドゲルを室温で60分間セットします。
1時間後、重合分離ゲルから0.1%SDS層を除去し、二重蒸留水でゲルをすすいでSDSの痕跡を取り除きます。積み重ねゲルミックスを分離ゲルに注ぎます。積み重ねゲルに櫛を入れ、櫛の周りから気泡を取り除きます。
その後、積み重ねゲルを室温で60分間セットします。くしを取り出し、水でゲルスロットをすすきます。ゲルタンクにゲルを入れ、ランニングバッファーで上部にゲルタンクを充填します。
5~10マイクロリットルの血漿膜サンプルを2倍のタンパク質負荷染料の等量で混合し、すぐにサンプル混合物を個々のゲルスロットにロードし、ランニングバッファに沈めます。タンパク質分子量マーカーを10~245キロダルトンの範囲で別のスロットにロードし、個々のタンパク質フラグメントのサイズ推定を可能にします。青い負荷染料がゲルの底に達するまで200ボルトでゲル電気泳動を行います。
ゲルイメージングシステムを用いて、インゲルGFP蛍光のゲルを調べます。蛍光イメージングに続いて、室温で15分間ゲルを緩やかに攪拌することにより、タンパク質固定溶液の10〜20ミリリットルのタンパク質固定液でタンパク質を固定した。その後、10ミリリットルの二重蒸留水で10分間2回洗い流し、室温で1時間穏やかに揺れるコロイドクマシ染色液10ミリリットルにゲルを入れてタンパク質バンドを視覚化します。
タンパク質バンドの視覚化を改善するために、ゲルイメージングシステムで画像を記録する前に、20ミリリットルの二重蒸留水中にゲルを1〜2回脱染色した。サッカロミセス・セレビシエA Dデルタの高周波変換は、プラスミドPS2の正の対照によって達成された。負のコントロールに対してユーロセル原トロン形質は得られない。
約50個のURA細胞原始眼CDR1-mGFPHis形質転換体は、CSMマイナスURAプレート上で変換されたADデルタデルタ細胞を3日間インキュベートした後に得られた。YPG寒天板上で成長できない小柄な変容剤を排除した。CDR1-mGHP様々な濃度のサンプルを、インゲル蛍光で定量した。
mGFP蛍光強度は、最小限のバックグラウンド蛍光で全濃度範囲にわたって線形であった。細胞密度を変化させることで、細胞の40 ODUを破壊すると、CDR1 ATPase活性が最も高い形質の膜が得られたことが示されました。しかし、細胞膜の収率は細胞密度の増加に比例して増加した。
ADデルタデルタの粗形質膜からCDR1-mGHPHisを可溶化する様々な特性を有する31の洗浄剤の能力を、CDR1-mGHPHis細胞はSDSページで試験した。ベータおよびアルファ DDM と Fos コリン 13 CDR1-mGHPHis を可溶化するのに最適な洗剤でした。.しかし, Fos コリン 13 CDR1-mGHPHis の部分加水分解を引き起こす.
粗血形質膜タンパク質を1%の洗剤で可溶化し、スーパーオス6を使用して分離し、10 300GLサイズの排除カラムを6個増加させた。マルトシドおよびLMNG抽出タンパク質のクロマトグラムは、CDR1-mGHPHisが凝集または広範な凝集ピークとしてほのめかした洗浄剤を含むグルコースで可溶化した15.5ミリメートルで、優れた形状のガウスピークとして排除するCDR1-mGHPHisを示した。DDMの高いピークは、DMN Gの大部分がCDR1-mGHPHisを変性する可能性があることを示した。
FSCCでは、ジウテリオニック・フォスコリンと2つの非イオン性洗剤のクロマトグラムは、ジギトニンのみを与え、DDMに同様のクロマトグラムを与えた。Fos-コリン 13 対称的なシャープな形状のピークを与えました, しかし、それはDDMのためのそれよりもかなり低い溶出量でほのめかした.また、最適化された二重タグは精製収率を向上させ、膜タンパク質の局在化、人身売買、熱安定性を決定するのに役立ちました。
異種発現技術は、高スループットの薬物スクリーニング、および他の多くの膜タンパク質の詳細な特性評価にも使用できます。
