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提示LEO-ワークフローはタンパク質消化物や合成ペプチドの安定同位体標識を可能にします。これらのタイムコース実験（ 図1）は、比較および定量的プロテオミクス研究ならびにプロテアーゼの研究にも適用可能である。各ワークフローには、2つの実験の手順（ 図2）から構成されています）は、それぞれ18のO-安定同位体でエンコードされた反応（プロテアーゼ触媒によるペプチド切断の解決されたサンプリング時間;プロテアーゼ触媒によるカルボキシル基の酸素交換反応、酸触媒カルボキシル酸素交換質量分析および18 O-取り込み動態をグラフィカルに表現することにより反応A）とB）分析。 Aの経時実験 I.古経時：タンパク質分解的切断のプロテアーゼ触媒によるラベリング<ol><li> （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、DTT（最終濃度2.5 mM）で還元される50℃で30分インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）で</li><li> （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。 </li><li>興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質試料用のバッファを交換するためにペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータ（ザルトリウス）のPepClean C-18スピンカラム（サーモ）を使用します。 </li><li> 1:1（v / v）の最終的なH 2を含む：;：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン50mMのMES-KOH、pH5.5で、ECE-1）に交換ペプチド/タンパク質/を再溶解（18）O（95％、シグマアイソテック）。 </li><li>前プロテアーゼの添加をゼロ時点サンプルを撤回：ミックス反応混合物の0.5μlと0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシを酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）。のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート（AB SCIEX）上のスポットサンプルを、室温で溶媒液滴のまま乾燥するまで（約5分）。 </li><li> 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：;：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMでトリプシン75nmのECE-1）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールサンプルとして使用されます。第一のアリコートは、プロテアーゼ触媒による18 O標識のための標準試料を表しており、タンパク質分解的切断反応のペプチドやタンパク質同定、タンパク質分解活性の検出およびモニタリングに使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって誘導されることを示すために使用されているため、どちらのラベルも切断はこのサンプル用に期待されています。 </li><li>反応液の一部を除去し、DESとしてそれらをスポッティングすることにより反応をフォローフィット思えるような時間間隔でステップ5にcribed。上記の反応条件は4日間（約24箇所）までのタンパク質分解反応を監視するために使用されています。 30分まで、5分毎のサンプリングを開始し、8時間、4日までのすべての8時間まで、2時間まで30分ごとに、すべての時間を見つける。切断産物は、最初の12時間以内に表示されるべきであり、基板は24時間後に完全に加水分解されなければなりません。拡張反応のインキュベーション時間はさらに処理される反応中間体から離散的で安定した反応生成物を定義することができます。リサーチクエスチョンと与えられた酵素 - 基質ペアに応じて、スポッティング倍、培養温度は最適反応サンプリングを確保するために調節されることがあります。 </li><li>最終反応時点をスポットまたは拡張スポッティング間隔の間にされた後、後述するように、MALDIターゲットプレート（セクションB）MALDI-TOF/TOF MS / MS分析に送信されます。 </li></ol> Ⅱ。古経時：Postdigタンパク質分解末端のestionラベリング<ol><li> （オプション）タンパク質（10μM）およびペプチド（250μM）のジスルフィド結合は、50℃で30分インキュベートし、25mMのNH 4 HCO 3（両方の新たに調製）にDTT（最終濃度2.5 mM）で還元される</li><li> （オプション）無料システインは、暗所で室温で30分間インキュベートすることにより、25mMのNH 4 HCO 3で（最終濃度10mM）ヨードアセトアミドでアルキル化されています。 </li><li>興味のあるプロテアーゼに応じて、タンパク質/ペプチドのソリューションは、残った液、アルキル化剤を除去するためにクリーンアップする必要があります。タンパク質のバッファー交換のためのペプチドのクリーンアップとVivaspin遠心コンセントレータのためPepClean C-18スピンカラムを使用します。 </li><li>再溶解/クリーンアップされたペプチド製品/タンパク質20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（ 例えば、トリプシン：25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0）に交換する（ 例えばトリプシン完成に関心のプロテアーゼで、ダイジェストを：0.04 nMで、37℃、12時間）。 </li><li> PepClean C-18スピンカラムによるクリーンアップの切断産物。このステップでは、残存プロテアーゼ活性を除去することができます。 </li><li> 1:1（v / v）の最終的なH 2 18 Oを含む：20μlのプロテアーゼ反応緩衝液（25mMのNH 4 HCO 3、pH8.0でトリプシン）でクリーンアップされたペプチド生成物を再溶解/交換</li><li>反応混合物のミックス0.5μlおよび0.5μlのアルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）：事前の酵素の添加をゼロ時点サンプルを撤回します。スポットMALDIターゲットプレート上の試料と乾燥（約5分）になるまで室温で溶媒液滴のままにしておきます。 </li><li> 2つのアリコートに反応液を分割します。室温または特定の酵素のための推奨温度で：最初のアリコートは、関心のあるプロテアーゼ（0.04 nMで例えばトリプシン）と共にインキュベートされます。第二のアリコートを、プロテアーゼなしでインキュベートされ、コントロールとして機能します。最初のアリコートプロテアーゼ触媒による18 O postdigestionラベリングのための標準試料を表しており、ペプチドやタンパク質の定量化のために使用することができます。第二のアリコートは、18 O取り込みがプロテアーゼによって触媒されることを示すために使用されているため、全く標識はこのサンプル用に想定されていません。 </li><li>反応液の一部を除去して、ステップ7で説明し、それらをスポッティングすることにより、反応に従ってください）​​時間間隔でフィット見えるように。例えば、私たちは、トリプシンによって触媒カルボキシル酸素交換反応を監視するために、その後最初に最大30分および15分毎にのために5分毎に斑点を付けた。 </li><li>最終反応時点が目撃されているか、（セクションB）下記のように拡張された間隔の間にスポッティングMALDIターゲットプレートがMALDI-TOF/TOF MS / MS分析に提出された後。 </li></ol> Ⅲ。アレオ-経時：カルボキシル基の酸触媒によるラベリング<ol><li> 1:1（v / v）のtの18 O濃縮水を使用して個々のペプチド（50 nM）をインキュベート0.1％の彼は有無（制御）（v / v）の最終のトリフルオロ酢酸（総体積30μl）を。 </li><li>アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸マトリックス（50％アセトニトリル中に10 mg / ml、0.1％TFA）で直接MALDIターゲット上の0.5μlとの混合物との共スポッティングを0.5μlアリコートで48日間毎日サンプルの反応生成物プレート。 </li><li>スポッティング間隔の間、そして、セクションBに下記のようにMALDI-TOF/TOF MS / MS分析のためのMALDIターゲットプレートを提出し、最終反応時点のスポッティング後</li></ol> B. MALDI-TOF/TOF MS / MSのデータ収集と分析<ol><li>質量スペクトルは4800 MALDI TOF / TOFアナライザ（AB SCIEX）に取得されています。 </li><li>分析前に、測定器は±50 ppmと一致するように、6つのピークの最小数の最大質量測定誤差の許容範囲を有するペプチド規格（AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット）の混合物で校正されています。 </li><li> MSスペクトル（質量範囲45000 - 2000の許容ベースピーク強度範囲とステップサイズ50）、400 - 3800 - 4000 メートル/ z）は調整可能なレーザー強度（3400と正イオンモードを用いて三重に獲得されます。シングルショットは合計400ショット/スペクトルと、サブスペクトルを取得し、800のサブスペクトル後に発効する停止条件（合格または不合格）が取得されるか400のサブスペクトルパス合格基準。低濃度サンプルの場合や複雑な生物学的背景の存在下でMS検出範囲の下限は800のm / zに引き上げるべきである。また、LC分離したり、前述のように、サンプルクリーンアップステップと塩と他の干渉成分を除去することが必要かもしれません。 </li><li> MSデータファイル（。T2Dファイル）は4000シリーズExplorerデータ収集ソフトウェアからエクスポートして、スペクトル処理、ピーク検出のマスコットDistillerのソフトウェア（マトリックスサイエンス）を利用して、社内の研究室情報システムにインポートされます。同位封筒自動的にメイソンらによって記載されたものと同様のアルゴリズムを用いて決定し、デコンボリューションおよび18 O-混入比率は12であり、当社グループ9で適応した。あるいは、このようなZoomQuant 13とバイパー14と同様に、このような市販のソフトウェアパッケージなどのソフトウェアツールは、 BioWorksエクスプレス（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とマスコットキャラクターDistillerの定量ツールとして（マトリックスサイエンス）18 O型データ15,16をデコンボリューションすることができます18、O-取り込み比（ すなわち 、16を含むペプチドの個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与として表されているO、18 O 1ま ​​たは18 O 2）を全体同位封筒へ。 </li><li>各時間経過の実験のために、分子量（[M + H] +）、検出されたすべてのペプチド種は、関連付けられたMSデータファイルから抽出された値が100 ppmの質量幅でビニングされるため。 </li><li> A少なくともトン3 [M + H] +のビンを移入するために必要とされるように設定されている。既知の基質の場合では、フィルタリングされたビンのリストがExPASy FindPeptツール17（使用基質ペプチド配列から予測されるタンパク質分解切断製品のリストと比較され<a href="http://au.expasy.org/tools/findpept.html" target="_blank">http://au.expasy.org/tools/findpept.html</a> ）と200 ppmの質量誤差の許容公差。 </li><li> MS / MSスペクトルをFindPeptツールによって、それらに関連付けられた18 O取り込みを持つビン値に対する予測切断産物の全質量の値で取得されています。 MS / MSデータは、オフモードで固定されたレーザー4200の強度と、CIDガスで、1kVのリフレクターポジティブイオンモードで4800 MALDI TOF / TOFアナライザで取得されています。 50ショットはアップスポットあたり40サブスペクトル（2000ショット/スポットの合計が得られる）との合計に対するサブスペクトル当たり無作為パターンで取得されています。 </li><li> MS / MSデータファイル（。T2Dファイル）は、4000シリーズの爆発からエクスポートされたRERのデータ収集ソフトと社内の検査情報システムにインポートされ、ピークが検出されるとMS / MSピークリストは、対応するビニングMSデータに関連付けられています。 </li><li>無酵素特異性、150ppmの前駆イオンと0.2 Daのフラグメントイオンの質量の許容差：ペプチド同定は、MS / MSピークリストは次の検索パラメータを指定してMASCOT検索エンジンを使用して、SwissProtデータベースに対して検索されます。 </li><li>ペプチド同定はさらにシェフチェンコらによって説明されているようにYシリーズのフラグメントイオンを越え特性18 O取り込みパターンを確認することにより、データエクスプローラソフトウェア（AB SCIEX）を使用して検証することができます18。 </li></ol>スペクトルの時間および18 O-定款プロットのRNAサンプルの調製 スペクトルの時間プロット：各反応時間ポイントのMSデータファイル（。T2Dファイル）を使用して、ASCIIファイルとしてデータエクスプローラソフトウェアからエクスポートされたマクロとデータ解析とグラフィックソフトウェアプログラム（OriginLabの起源などによる）にインポートして、ウォーターフォールプロット（ 図3）として表示されます。 18 O取り込みプロット：各ビニングペプチド切断の製品については、個々のペプチドの同位体種の相対的な寄与（16 O、18 O 1ま ​​たは18 O 2）をすべて反応時間ポイント間で抽出されます（ 図4）を時間に対してプロットした。

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S., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+and+identification+using+18O+labeling+with+an+ion+trap+mass+spectrometer+and+the+analysis+software+application+"ZoomQuant&amp;quot.">Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant&amp;quot.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).</li><li>Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-catalyzed+oxygen-18+labeling+for+quantitative+proteomics.">Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics.</a> Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).</li><li>Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. 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J., Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-catalyzed+oxygen-18+labeling+of+peptides.">Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.</a> Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).</li><li>Bender, M., Stone, R., Dewey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+Isotopic+Oxygen+Exchange+between+Substituted+Benzoic+Acids+and+Water.">Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).</li><li>Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+proteomes+with+proteotypic+peptide+probes.">Scoring proteomes with proteotypic peptide probes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

時間分解方法で、安定同位体標識と​​高分解能質量分析を組み合わせることで、古経時方法は、ペプチド生成物の生成の動的解析が可能になります。アッセイは、定量的および定性的プロテオミクス研究のための安定同位体で標識されたペプチドを生成するとプロテオティピックペプチドが生成されることにより反応速度を評価するために用いることができる。さらに、古経時は、特定の?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> PepClean C-18スピンカラム</td><td>サーモ</td><td> 89870 </td></tr><tr><td>のOpti-TOF 384 MALDIターゲットプレート</td><td> AB SCIEX </td><td> 1016629 </td></tr><tr><td> 4800 MALDI TOF / TOF </td><td> AB SCIEX </td><td></td></tr></tbody></table> 表1材料<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>アルファシアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 70990-1G-F </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3294-10G </td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td&gt;アクロス</td><td> 16568-0050 </td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド（IAM） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 1149-5G </td></tr><tr><td>酵素-1（ECE-1）を変換エンドセリン</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 1784-ZN </td></tr><tr><td>トリプシンゴールド</td><td>プロメガ</td><td> V5280 </td></tr><tr><td>水- 18 O、97原子％ の18 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 329878-1G </td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸（TFA） </td><td>サーモ</td><td> 28904 </td></tr><tr><td> AB SCIEX TOF / TOF機器のキャリブレーションのための質量標準キット</td><td> AB SCIEX </td><td> 4333604 </td></tr></tbody></table> 表2試薬

protease- and acid-catalyzed labeling workflows employing 18o-enriched water

安定同位体は、生物学質量分析に不可欠なツールです。歴史的に見ると、18 O安定同位体は、広範囲に1から3のタンパク質分解酵素の触媒機構を研究するために使用されている。質量分析ベースのプロテオミクスの出現により、安定同位体濃縮された水の18 O原子の酵素によって触媒された定款は、定量的タンパク質発現レベル（Fenselauとヤオ4県、宮城県、ラオ5とYeによって見直さ比較する一般的な方法となっているら6）18 O標識は、化学物質（ 例えば iTRAQ、ICAT）と（ 例えば SILAC）代謝標識技術7に簡単かつ低コストの代替手段を構成する。利用プロテアーゼに応じて、18 O標識は、切断産物3のC末端カルボキシル基に2つの18 O原子までの取り込みをもたらすことができ</sup&gt;。標識反応は、2つの独立したプロセスが、ペプチド結合切断とカルボキシル酸素交換反応8に細分することができる。酵素18 O標識の私たちのパレオ（P 18 O濃縮水をmploying 電子 abeling rotease-ssisted リットル ）の適応では、独特の同位体比の挙動を得るために50パーセント18 O濃縮水を利用した。高解像度のマトリックス支援レーザー脱離イオン化 - 飛行時間型タンデム質量分析（MALDI-TOF/TOF MS / MS）との組み合わせでは、特徴的な同位体エンベロープは特異性の高いレベルで切断産物を同定するために用いることができる。我々は以前に検出し、特徴づける内因性プロテアーゼ9とタンパク質分解反応10-11を監視するために古の方法論を使用してきました。パレオは、タンパク質分解的切断反応の本質をエンコードしているので、実験のセットアップは簡単で、生化学ENRIです切断産物のchmentステップは回避することができます。古法は容易にタンパク質分解的切断反応のダイナミクスと生理的条件を表す複雑な生物学的サンプル中のタンパク質分解の（ii）の分析の監視（i）が経時実験に拡張することができます。古経時実験は、複雑なタンパク質分解経路反応における律速処理ステップと反応中間体を識別するのに役立ちます。さらに、古反応は、私たちはそのようなその切断産物を再結合し、第二18 O原子の取り込みを触媒することが可能であるセリンプロテアーゼトリプシンなどのタンパク質分解酵素を識別することができます。このような&quot;二重標識&quot;酵素はペプチドが排他的にカルボキシル酸素交換反応によって標識されている、postdigestion 18 O標識のために使用することができます。私たちの3番目の戦略は酵素を超え18 O濃縮水を採用ラベリング延び、18 O安定同位体標識を導入するために酸性のpH条件を使用していますペプチドにatures。

我々は、動的にタンパク質分解酵素によって生成されたペプチドの切断産物に18 O安定同位体の取り込みを監視するために古経時ワークフローを使用していました。提示されたアプローチは比較的異なる基板とプロテアーゼの組み合わせに分解性プロセシング経路を研究するための多目的ツールです。反応の過程で繰り返しタンパク質分解反応をサンプリングすることにより、古経時?...

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Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

採用した安定同位体標識のワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水（LEO-ワークフロー）を定量的および定性的プロテオミクス研究のための多目的ツールです。プロテアーゼアシスト（古）のワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は、タンパク質分解切断、およびプロテアーゼによって媒介されるカルボキシル酸素交換反応によって導入されます。酸触媒（アレオ）ワークフローでは、<sup&gt; 18</sup&gt; O原子は低pHでカルボキシル酸素交換によって導入されます。

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Research

JoVE Journal

Biology

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

11.9K ビュー.  Boston Biomedical Research Institute. 採用した安定同位体標識のワークフロー 18 O-濃縮水（LEO-ワークフロー）を定量的および定性的プロテオミクス研究のための多目的ツールです。プロテアーゼアシスト（古）のワークフローでは、 18 O原子は、タンパク質分解切断、およびプロテアーゼによって媒介されるカルボキシル酸素交換反応によって導入されます。酸触媒?...

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

モリス水迷路実験

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases, which is what we do during our quality control procedures. In this assay, casein acts as a substrate. When the protease we are testing digests casein, the amino acid tyrosine is liberated along with other amino acids and peptide fragments. Folin and Ciocalteus Phenol, or Folin's reagent primarily reacts with free tyrosine to produce a blue colored chromophore, which is quantifiable and measured as an absorbance value on the spectrophotometer. The more tyrosine that is released from casein, the more the chromophores are generated and the stronger the activity of the protease. Absorbance values generated by the activity of the protease are compared to a standard curve, which is generated by reacting known quantities of tyrosine with the F-C reagent to correlate changes in absorbance with the amount of tyrosine in micromoles. From the standard curve the activity of protease samples can be determined in terms of Units, which is the amount in micromoles of tyrosine equivalents released from casein per minute.
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Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases. Sigma's non-specific protease activity assay may be used as a standardized procedure to determine the activity of proteases.

シグマの非特異的プロテアーゼの活性アッセイ - 基質としてカゼイン

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

の蛍光標識ショウジョウバエハートの構造

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

プロテアーゼ活性を測定するためにプロテアーゼ蛍光検出キットの使用

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

土壌中の微生物の残留決定のためのAldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンとムラミン酸のGCベースの検出

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...