この作品は、DMHとTDM（NHMRCプロジェクトの助成金）への補助金によって賄われていた。 DMHはMiegunyahトラストが資金提供グリムフェロー、です。

1。 ReAsH / Flashで標識化するための細胞の調製<ol><li>興味のある細胞株の標準的な細胞培養法を用いて、直接トランスフェクションのための準備ができて、ライブセルイメージングのスライドでの付着細胞の培養物を準備。 </li><li>好みのトランスフェクション法にしたがって目的のプラスミドを含むTC -タグ付き遺伝子をトランスフェクション。 </li></ol>それは、TCのタグに特異的結合の程度を評価すると共焦点顕微鏡写真を収集し、チャネル間の蛍光のbleedthroughのために評価するために、ポジティブとネガティブコントロールを使用することが重要です。したがって、2つの色（例：Flash /チェリーまたはReAsH / CFPまたはReAsH / GFPの組み合わせ）のために、サンプルは、単一の色（例えば蛍光タンパク質単独で、または、可能であれば無蛍光灯とフラッシュ/ ReAsHだけにバインドされているTC -タグ融合タンパク質のために用意されていることを確認蛋白質） <ol start="3"><li> 1〜2日間トランスフェクション後、静かに300μL予め温めておいた（37℃）HBSSで細胞をリンス。 </li><li>優しく温めておいたHBSSと10μMの1,2 - エタンジチオール（EDT）300μlで1μMのフラッシュ（またはReAsH）で細胞を浸す。 </li></ol>細胞にそれを追加するには、Flash / ReAsHを追加する前に、EDTを追加し、直前にバッファを作成することが重要です。 37℃で正確に30分間インキュベート組織培養インキュベーターでCを。我々の経験より長いインキュベーション時間が大幅にバックグラウンド蛍光を増加させる。新しい構文はまた時間およびFlash / ReAsH濃度（0.5-2μM）標識に最適化する必要があります。 <ol start="5"><li>静かに細胞から標識溶液を吸引し、300μL温めておいたHBSS + 37℃で15分間では250μM2,3 - dimercaptopropanol（BAL）と交換してください</li><li>穏やかな吸引により溶液を洗浄し、300μL温めておいたHBSSで置き換える取り外します。 </li></ol>我々は、これは非特異的biarsenical色素の蛍光を増大させることを発見したが、この洗浄後、細胞は、（3.2％溶液で15分間）パラホルムアルデヒドで固定してもよい。したがって、私たちは通常、画像の細胞は、室温で生活しています。 （ラベリングの前に細胞を固定がbiarsenical色素の結合を妨げることに注意してください。） 2。イメージング共焦点顕微鏡で細胞<ol><li>共焦点顕微鏡では、画像の個々の蛍光物質（表1参照）のパラメータを設定し、チャネル間の無視bleedthroughがあることを確認してください。これは、蛍光用のそれぞれ異なる蛍光取得の設定に対して、個々の蛍光物質を（コントロールサンプルで）チェックすることによって達成することができます。発光波長範囲を調整することで（これはまた、信号/ノイズを低減することができます）bleedthroughを最小限に抑えることができます。 </li><li>また、サンプル中の最大蛍光は検出器を飽和させないように光電子増倍管の設定を調整します。 （これは、SP2ライカ共焦点でQ - LUTの設定値を用いて検出することができる）。かつて最高のイメージング設定が決定されている、サンプル間のそれらのいずれかを変更しないでください。 </li><li>我々は一般的に使用するその他の設定は、（これらを最適化することができますが）200Hzのスキャン率であり、4行の平均値と1エアリーユニットのピンホール径を収集する。ピンホールの直径は、信号/雑音が問題となる場合、しかし、これは画像の一部失われる可能性が拡大することができます。 </li><li>可能であれば12ビット（またはそれ以上）の形式で共焦点画像を収集する。 12ビットのフォーマットは8ビット（0〜255）より各ピクセルの輝度値（0〜4095）の広いダイナミックレンジをキャプチャします。これは定量的なデータ分析の質を最大にする、最も豊富なデータセットが記録されることを保証するために重要です。 </li><li>蛍光タンパク質のチャンネル（チェリー、GFPまたはCFP）のため、また、全てのサンプルに対してbiarsenical色素のチャンネル（FlashまたはReAsH）の画像を収集する。 </li></ol> 3。データの分析<ol><li>お使いのコンピュータ8日にソフトImageJをインストールします。 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJのバージョンが以下のプラグインを持っていることを確認してください： <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li>オープンImageJの、そしてv1.32cよりも古いバージョンを使用している場合は、複数の画像を一度に（別のファイルをクリックしながらコントロールのボタンを押しながら行うことができる）で開くことができるようにするには、次のオプションをクリックしてください： <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="図1" /></li><li> ImageJの関心の画像を開きます。 ImageJは自動的に別々にそれぞれの画像の画面上に表示される最大値と最小値の画素の強度を定義します。別の画像は、dがあることを考えるとifferentピクセルの強度、これは見たときに表示される画像は比較できないことを意味します。 </li><li>開かれたイメージが同じスケールですべてであることを保証するためには、物理​​的に（いくつかの他のソフトウェアの場合のように、これは画像の実際のデータの内容は変更されません）見られるように、上下のピクセルの強度を定義することができます。これらの値は、以下のメニューで設定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="図2" /></li><li>別のアプローチは、一つのファイルにまとめ、すべての画像を置くと自動的に同じスケールに（表示用）スタック内のすべての画像を拡大縮小されるスタックで動作するようです。データを操作する最も簡単な方法は、スタックの各チャンネルに変換することです。このように、蛍光タンパク質のチャネルに示すようにスタックにすべて変換します。あなたは簡単にタイトルに共通の名前（例えば&quot;CH00&quot;）を含むすべての画像を積み重ねることによって片方のチャンネルを選択することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="図3" /></li><li>今分析のために8ビットに開いているすべての画像を変換する。これは実際には0〜255の範囲（8ビットを定義します）に表示範囲を再スケーリングされます。 重要 ：オリジナルの12ビット（またはそれ以上）の形式上の保存するか、またはあなたが情報の内容を失うことにしないでください。このフォーマットは、数字などを作るのに便利ですので、一部のソフトウェアパッケージが唯一の8ビット画像を表示できることに注意してください <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="図4" /></li><li> &quot;8ビットの変換&quot;&quot;名前を付けて保存...&quot;オプションを使用して、という名前の新しいフォルダにコピーを保存します。 </li><li>画像全体にbiarsenical色素の結合の程度を調べるために一つの方法は、ピクセル輝度の相関プロットを実行することです。これはプロット番目のチャネルの対応するピクセル値に対する相対的な一つのチャネル内のすべてのピクセル値を。結合高がある場合したがって、CFPの蛍光の高画素の位置はまたReAsH蛍光に高くなります。 </li><li>共同相関ピクセルを解析するために、8ビットのReAsHとセルリアン/ GFP画像はImageJので開いていることを確認してください。 </li><li>以下に示すように、&quot;画像相関器&quot;プラグインを開きます。 ReAsHまたはFlashスタックと蛍光タンパク質のスタックとして&quot;画像2&quot;として&quot;画像1&quot;を選択します。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="図5" /></li><li>結果としてスタックは詳細情報が表示されないことがあります - これは正常です。 &quot;散布図&quot;と呼ばれる新しいフォルダにスタックを保存し、それが参照するサンプルと同じファイル名を（例えば、&quot;FLASH -桜の相関プロット&quot;）与える</li><li>意味のあるデータを表示するには、2つのオプションのいずれかを行うことができます。最初にログの形式になるようにデータを変換する。その後、視覚的に次のようにデータを再スケーリング： <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="図6" /></li><li>また、あなただけの低い値（例えば1〜255）を表示し、特別なLUTを使用してデータを表示するために視覚的にデータを再スケーリングすることができます。LUT（ルックアップテーブル）イメージの各ピクセル値に割り当てられている色のテーブルを表します。これは、画像の擬似カラースキームを定義するために使用し、画像内の特定の機能を定義する場合に便利ですできます。 &quot;LUTエディタ&quot;上のカスタムLUTをクリックして作成すると示されているもの（これを保存して後で使うことができます）などの新しいものを作る。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="図7" /></li><li> 0から255までの明るさ/コントラストの範囲を（上記の手順13で説明）を設定します。画面上に示されているのようにイメージ&quot;でロックする&quot;ために、画像は各ピクセルの赤、緑、青の各8ビットの値を保存RGBフォーマットに変換することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="図8" /> 他のプログラムへ画像をコピー＆ペーストするには、最初の8ビットまたは16ビットの画像を開きます。上記の手順14で説明したように、画像のLUTのカラースキームを割り当てます。 CFPについては、下記のように&quot;シアン&quot;LUTを割り当てる... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="図9" /></li><li>イメージを選択し、クリップボードにコピーする、を選択... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg" /></li></ol> 4。代表的な結果： biarsenical色素で標識する細胞の成功は、いくつかの重要なパラメータに依存しています。最初に、染料でラベルのタイミングが重要です。我々は発見したそのラベルの長時間（30分以上）非特異的バックグラウンド染色の高レベルの結果。図1は、以前に7を説明するようにTCのタグを含むCFP派生セルリアンに融合したハンチンチン断片（25Q）の野生型形態の典型的な結果を示しています。このサンプルはReAsHで30分間染色し、最小限の背景には、TCタグを欠く試料に存在した。我々は、メタノールで固定しながらパラホルムアルデヒドの増加の背景を持つ細胞を固定する蛍光タンパク質タグの蛍光をabrogatesことを発見した。したがって、可能であれば、細胞が生きる我々がイメージ。また、その前固定に注意することが重要ですbiarsenical色素で標識することはおそらくTCモチーフの変更にともなってそれらの結合を防ぎます。 一貫性のある結果を得るためのもう一つの重要な要素は、細胞の密度です。我々は、大まかに大規模な塊が別々のセルにbiarsenical染料の不均一な染色につながることも、分散している画像の細胞にそれが重大な発見した。 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。テトラタグとハンチンチン（exon1 - 25Q） -セルリアン融合でトランスフェクトした生細胞におけるReAsH染色。 TCタグは、ハンチンチン-セルリアン融合（7に記載のように）の合流点に位置しています。ピクセル強度の相関プロットは、セル全体結合ReAsHの違いにアセスメントを可能にし、コンホメーション変化またはリガンドの相互作用による結合ReAsHの変化をマッピングするために使用することができます。

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	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-2672 (1998).</li><li>Uttamapinant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorophore+ligase+for+site-specific+protein+labeling+inside+living+cells.">A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).</li><li>Ignatova, Z., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+protein+stability+and+aggregation+in+vivo+by+real-time+fluorescent+labeling.">Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).</li><li>Coleman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+detection+of+prion+protein+with+biarsenical+labeling+and+FlAsH+fluorescence.">Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).</li><li>Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+polypeptide+and+protein+domain+conformation+and+association+with+FlASH+and+ReAsH.">Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).</li><li>Ramdzan, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+sensors+that+distinguish+monomeric+proteins+from+oligomers+in+live+cells.">Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells.</a> Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).</li><li>Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Hearps, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biarsenical+dye+Lumio+exhibits+a+reduced+ability+to+specifically+detect+tetracysteine-containing+proteins+within+live+cells.">The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells.</a> J. Fluor. 17, 593-597 (2007).</li><li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

第二の色素と蛍光タンパク質とコンホメーション特性を持つラベルのタンパク質局在化へのアプローチは、タンパク質の異なるコンフォメーションは、細胞やタンパク質の立体構造のダイナミクスを変更するイベントに積算どこにマッピングするための多くの潜在的な提供しています。 ReAsH /フラッシュは、最初の哺乳類細胞内レチノイン酸結合タンパク質I 4のタンパク質の折り畳み...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> μ-スライド8ウェル</td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td>我々は、これらのチャンバは、イメージングのための細胞を培養するために特に有用であるとスライド見つける。 </td></tr><tr><td>キット*緑色蛍光* *生細胞イメージングのためのTC - FLASH IIセル内のテトラタグ検出</td><td>インビトロジェン</td><td> T34561（フラッシュ）またはT34562（ReAsH） </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩類溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3 - ジメルカプト-1 - プロパノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D1129 - 5mlの</td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - エタンジチオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash/flash labeling and image analysis of tetracysteine sensor proteins in cells

蛍光タンパク質と色素が細胞内のタンパク質輸送、局在化と機能の研究に欠かせないツールです。このような緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質は広く関心1のタンパク質の特性を追跡するために蛋白質に融合パートナーとして使用されているが、小さなタグと最近の進展は、このようなコンフォメーションの変化などの細胞で検査されるタンパク質の新しい機能を有効にすると蛋白質-関連2、3。一つの小さなタグでも、システムは生細胞に高い特異性と2を遺伝的にbiarsenical染料に結合する標的蛋白質、挿入テトラのモチーフ（CCXXCC）、ReAsH（赤色蛍光）とFLASH（緑色蛍光）を伴います。 TC / biarsenical染料のシステムは、コンフォメーション変化とタンパク質間相互作用4-7測定するためにいくつかの新しいアプローチを有効にしている蛍光タンパク質よりもホストのタンパク質へのはるかに少ない立体制約を提供しています。我々は最近、ハンチントン病7の神経細胞に凝集体を変異変異ハンチンチンを発現する細胞のオリゴマー化のセンサーとして、TCタグの新規な用途を開発した。ハンチンチンは、2つの蛍光色素、一つのタンパク質の場所を追跡するために蛍光タンパク質、及びだけモノマーのbiarsenical色素を結合する第二TCタグでタグ付けされた。したがって、タンパク質とbiarsenical染料の反応性との間の共局在の変化は、空間的に細胞内にマッピングする顕微鏡的オリゴマーのコンテンツを有効にする。ここでは、FlashやReAsH生哺乳動物細胞での方法、および2つの色の蛍光（チェリー/フラッシュ、CFP / / FlashやGFPを定量化すると蛍光タンパク質（チェリー、GFPまたはCFP）に融合されたTC -タグタンパク質を標識する方法について説明します。 ReAsHの組み合わせ）。

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ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

biarsenical染料FlashとReAsHは、タンパク質のテトラモチーフに特異的に結合し、選択的に生細胞内のタンパク質にラベルを付けることができます。最近このラベリング戦略は、異なるタンパク質のコンフォメーションまたはオリゴマー状態のセンサーを開発するために使用されています。我々は、定量的に結合分析するためにラベルをつける方法とメソッドを説明します。

ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K ビュー.  Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute. biarsenical染料FlashとReAsHは、タンパク質のテトラモチーフに特異的に結合し、選択的に生細胞内のタンパク質にラベルを付けることができます。最近このラベリング戦略は、異なるタンパク質のコンフォメーションまたはオリゴマー状態のセンサーを開発するために使用されています。我々は、定量的に結合分析するためにラベルをつける方法とメソッド?...

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

生物学

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

半翅目腸内における植物ウイルスおよび昆虫ベクタータンパク質の免疫蛍光標識

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...