Ce travail est soutenu par la National Science Fibr Foundation (NSF EF-0623664) et IDBR (NSF DBI-0754570). Ce travail a été partiellement financé par des fonds de la National Science Foundation Grant Fibr 0623664 administré par le Centre pour la biophotonique, une science NSF et de la technologie Center, géré par l&#39;Université de Californie, Davis, en vertu de l&#39;accord de coopération PHY 0120999. La recherche de Lisa Lapidus, Ph.D. est soutenu en partie par une bourse de carrière à l&#39;interface scientifique du Fonds Burroughs Welcome.

<ol>
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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Mélange rapide a été un objectif de développement pour le champ du repliement des protéines pour de nombreuses années, car il est reconnu depuis longtemps que les processus moléculaires de biomolécules se produire sur des échelles de temps allant de picosecondes à quelques secondes. Classiques stopped-flow mélangeurs ont des temps morts de 1-5 ms, ce qui est principalement limitée par les turbulences. Turbulent mélangeurs à flux continu avec un temps de mélange de 30-300 ms ont été développés au cours des 15 dernières années par un petit nombre de groupes mais exigent généralement des débits élevés pour atteindre ces temps de mélange et donc d&#39;utiliser un grand nombre de l&#39;échantillon 6-8. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de puces microfluidiques mélange pour obtenir une dilution rapide dans le régime d&#39;écoulement laminaire. Il ya de multiples avantages à travailler au sein de ce régime, mais un primaire est la possibilité de simuler l&#39;ensemble du processus de mélange avec une grande précision qui permet de modifier la réponse de mélange. T-mélangeurs développés par d&#39;autres groupes avec de simples geometries ont démontré un temps de mélange de 100-200 ms qui ont été principalement limités par la taille des canaux 9-10. Mettant à l&#39;échelle de la taille des canaux à 10 um chevalier de réduire le temps de mélange d&#39;environ 10 ms 11. Yao et Bakajin a montré que de petits changements dans la géométrie pourrait conduire à des améliorations significatives dans le temps de mélange 4. Toutefois, ce travail a montré que l&#39;accélération du mélange peut aussi conduire à un ralentissement des phases ainsi. La conception utilisée dans ce travail 12-13 est un compromis entre les deux meilleures designs de référence de 4 à minimiser le plus lent de décroissance exponentielle de la concentration en dénaturant et aussi pour rendre la fonction plus reproductible dans gravure DRIE. Il a eu une certaine controverse dans le domaine de la ultrarapide mélange sur la définition du temps de mélange. Il est important de reconnaître la différence entre &quot;temps de mélange» et «temps mort». Le temps mort est définie dans un mélangeur turbulente que le temps pendant lequel une MESUREt ne peut être faite et peut en fait être beaucoup plus long que le temps réel de mélange. Il est généralement déterminée en faisant plusieurs mesures d&#39;une réaction pseudo-premier ordre bimoléculaire (tels que trempe de fluorescence du tryptophane par N bromosuccinate) à différentes concentrations. Des caries observées exponentielles sont montés à converger à une valeur unique supposé être t = 0 s et le temps entre ce point et le premier point de mesure est le temps mort. Pour les mélangeurs à flux laminaire, des mesures peuvent être prises durant le processus de mélange de sorte qu&#39;il n&#39;ya pas de temps mort, seulement un temps de mélange. Le temps de mélange est tout simplement le temps de combiner deux solutions jusqu&#39;à ce que l&#39;uniformité suffisant est atteint. Nous avons défini précédemment le temps de mélange d&#39;un temps de 90/10, le temps de la concentration de dénaturant pour diminuer de 90% à 10% de la valeur sans mélange. Toutefois, la forme de la courbe de mélange n&#39;est pas parfaitement symétrique avec la queue de la désintégration ayant un petit composant exponentielle. En outre, le repliement des protéines a unefortement non-linéaire de dépendance sur la concentration de dénaturant de telle sorte que pliage peut souvent commencer même si le dénaturant est seulement réduit par deux fois. C&#39;est pourquoi nous avons plus récemment défini le temps de mélange que le temps de réduire la concentration de dénaturant de 80%. Certes, d&#39;autres définitions peuvent être utilisées en fonction des exigences de l&#39;expérience. L&#39;utilisation de cette table de mixage pour étudier le repliement des protéines a toujours révélé des résultats surprenants. Pliage de cytochrome c et apomyoglobine ont longtemps été étudiée pour avoir de multiples étapes de pliage et les premiers résultats avec des mélangeurs à flux continu ont montré l&#39;effondrement de se produire sur l&#39;échelle de temps ~ 100 ms 10,14-15. Nos mesures ont montré avec cette table de mixage qu&#39;il y ait au moins 2 étapes sur cette échelle de temps, un très rapide, probablement non spécifique, l&#39;effondrement (tel que mesuré par fluorescence Trp décalage spectral) dans le temps de mélange du mélangeur suivie par une phase plus lente (comme mesurée par la trempe du total des émissions de Trp) qui est probablement le fla formation de la structure native IRST 5. Nous avons également observé un processus 50 ms dans le domaine B1 de la protéine L, renversant l&#39;interprétation conventionnelle que cette protéine est un dossier 2-Etat 13. Un avantage de cette table de mixage rapide, c&#39;est qu&#39;il permet de sonder le repliement de protéines les plus rapides pliantes qui ont habituellement seulement été mesurable par ordre de la nanoseconde T-saut instruments. T-saut nécessite généralement l&#39;observation de pliage / dépliage détente à proximité de la température de fusion de la protéine et donc ne suit jamais le pliage de la population dans son ensemble. Avec cette table de mixage, nous avons examiné le pliage de la γ-répresseur (λ 6-86) à la fois les émissions totales Trp et décalage spectral et ont trouvé des preuves que la protéine n&#39;a pas de barrière à plier sous de fortes conditions de pliage qui n&#39;étaient pas accessibles à T précédentes -sauter des mesures 12. Enfin, nous avons mesuré le repliement de la coiffe villine HP-35, l&#39;un des til le plus rapide des dossiers encore mesuré et a constaté que le taux de pliage mesuré après le mélange est de ~ 5 fois plus lent que mesurée par T-bond dans les mêmes conditions 16. Ceci suggère que la cinétique de pliage dépend des conditions de départ, le renversement d&#39;une hypothèse majeure dans le domaine.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> AZ P4110 Photoresist </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Developer </td><td> AZ Electronic Materials </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PRS Baker, 2000 décapant résine photosensible </td><td> Performance Materials Avantor </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> Technologies AquaBond </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 plaquette de recouvrement pm </td><td> CAPTEUR services de préparation </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Épaisseur: 0,5 mm ± 0,025 mm Tolérances standard (sauf indication contraire) Finition de la surface: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartements: Une primaire SEMI-STD; un scribe Propre et poli, des deux côtés </td></tr><tr><td> 170 plaquette de recouvrement pm </td><td> CAPTEUR services de préparation </td><td> 7980 Gaufrettes 2G </td><td> Ø: 100 mm ± 0,5 mm Epaisseur: 0,17 mm ± 0,025 mm Tolérances standard (sauf indication contraire) Finition de la surface: SI: 4-8a; SII: 8-12A Appartements: Une primaire SEMI-STD; un scribe Propre et poli, des deux côtés </td></tr><tr><td> Profonde graveur ionique réactive pour les oxydes </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Laser à ions argon </td><td> Cambridge Laboratories laser </td><td> Lexel 95-SHG </td><td> X = 258 nm </td></tr><tr><td> Laser à ions argon </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> X = 488 nm </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Olympe </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Objectif de microscope </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA </td><td> X = 258 nm </td></tr><tr><td> Objectif de microscope </td><td> Olympe </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> X = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad Labs Ville </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Stade Traduction motorisé </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-Série 12-6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Photon contre </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochromateur </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Andor Technology </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

Le processus par lequel une protéine se replie dans sa conformation native est très pertinente pour la biologie et la santé humaine mais encore mal compris. Une raison à cela est que le pliage a lieu sur une large gamme d&#39;échelles temporelles, de la nanoseconde à quelques secondes ou plus, en fonction de la protéine 1. Classiques stopped-flow mélangeurs ont permis de mesurer la cinétique de pliage à partir d&#39;environ 1 ms. Nous avons récemment développé un mélangeur microfluidique qui dilue dénaturant ~ 100 fois dans ~ 8 ms 2. La différence d&#39;un mélangeur de flux arrêté, ce mélangeur fonctionne dans le régime d&#39;écoulement laminaire dans lequel la turbulence ne se produit pas. L&#39;absence de turbulence permet la simulation numérique précise de tous les flux au sein de la table de mixage avec un excellent accord pour expérimenter 3-4. À flux laminaire est atteint pour des nombres de Reynolds Re ≤ 100. Pour les solutions aqueuses, ce qui nécessite des géométries échelle du micron. Nous utilisons un substrat dur, tel que le silicium ou fusionnés siliconeca, pour faire um canaux 5-10 de large et 10 um de profondeur (voir figure 1). Les plus petites dimensions, à l&#39;entrée de la zone de mélange, sont de l&#39;ordre de 1 pm à la taille. La puce est scellé avec une lamelle de verre mince ou en silice fondue pour l&#39;accès optique. Typiques au total des débits linéaires sont ~ 1 m / s, Re cédant ~ 10, mais la consommation de protéines est seulement ~ 0,5 nL / s ou 1,8 pi / h. La concentration en protéines dépend de la méthode de détection: Pour fluorescence du tryptophane la concentration typique est de 100 um (pour 1 Trp / protéine) et pour FRET de la concentration typique est de ~ 100 nM. Le processus de pliage est initiée par dilution rapide de dénaturant de 6 M à 0,06 M de chlorhydrate de guanidine. La protéine en dénaturant haute coule un canal central et est remplie de chaque côté à la zone de mélange par le tampon, sans dénaturant le déplacement ~ 100 fois plus rapide (voir Figure 2). Cette géométrie provoque la constriction rapide de l&#39;écoulement des protéines dans une étroitejet ~ 100 nm de large. Diffusion des molécules légères dénaturant est très rapide, tandis que la diffusion des molécules de protéines lourds est beaucoup plus lente, la diffusion inférieure à 1 um à 1 ms. La différence de constante de diffusion de l&#39;agent de dénaturation des protéines et des résultats de dilution rapide de l&#39;agent de dénaturation des protéines à partir du flux, la réduction de la concentration efficace de l&#39;agent de dénaturation autour de la protéine. Le jet protéine s&#39;écoule à une vitesse constante dans le canal d&#39;observation et de la fluorescence de la protéine pendant le pliage peut être observé à l&#39;aide d&#39;un microscope à balayage confocal 5.

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Dans ce travail nous expliquer la fabrication et l&#39;utilisation d&#39;un mélangeur microfluidique capable de mélanger deux solutions dans ~ 8 ms. Nous démontrons également l&#39;utilisation de ces mélangeurs avec détection spectroscopique utilisant la fluorescence UV et de fluorescence de transfert d&#39;énergie par résonance (FRET).

Mélangeurs microfluidiques pour étudier repliement des protéines

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vues.  Michigan State University. Dans ce travail nous expliquer la fabrication et l'utilisation d'un mélangeur microfluidique capable de mélanger deux solutions dans ~ 8 ms. Nous démontrons également l'utilisation de ces mélangeurs avec détection spectroscopique utilisant la fluorescence UV et de fluorescence de transfert d'énergie par résonance (FRET).