著者らは、イラストで芸術支援のためヴァンダービルト大学医療センターとメリッサA. Musserでフローサイトメトリーの共有リソースでサポートするために細胞解離の方法とケビン·ウェラー、デビッド·フラハティとブルターニュマトロックの提案のためにキャサリン·アルフォードに感謝します。我々は、博士に感謝します。神経前駆細胞の分離を実装する上でのアドバイスジャックモッシャーとショーンモリソン。 VMCフローサイトメトリーの共有リソースは、ヴァンダービルト·イングラムがんセンター（P30 CA68485）とヴァンダービルト消化器病研究センター（P30 DK058404）によってサポートされています。この作品は、健康補助DK064251、DK086594、とDK070219の米国国立研究所からの資金によって支えられている。

1。メディアの準備（組織培養フード内で行ったすべてのステップ） <ol><li>次の手順を組み合わせる：44 mlのL-15培地、0.5ミリリットル100Xペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）、0.5ミリリットルが100 mg / mlウシ血清アルブミン（BSA）、0.5ミリリットル1M HEPES、5 mlの組織培養グレードの水。追加する前に徹底的にBSAとP / Sを混在させるようにしてください。このボリュームは、最大の解離のための5つの異なる組織の種類に適切でなければなりません。このメディアは、組織の酵素的解離後に使用するために焼入れ溶液を調製するには、手順3.4で使用されます。 </li><li>フィルターメディア0.22μmのポリエーテルスルホン（PES）フィルタけど。 </li><li>組織培養グレードの水を使用して、10倍株から緩衝生理食塩水（PBS）1Xハンクス平衡塩溶液（HBSS）と1Xリン酸塩を準備します。 0.22μmのPESフィルターを通してろ過する。これらの試薬の大ボリュームは前もって準備し、4℃で保存し、必要に応じて組織培養フードの小さいボリュームを分注することができます。 </li><li> 1X HBSS、（使用して複数の15 mlコニカルチューブを埋める氷の上で、サブ解剖を計画し、組織の数）を保持するチューブを等しくなるように管の数。 </li></ol> 2。解剖<ol><li>制度の動物のケアに応じてタイミング妊娠中のマウスを安楽死させる、氷冷1X PBSを含む60または100 mmペトリ皿に委員会が承認したプロトコルと転送子宮を使用しています。 </li><li>子宮から胚を取り出して、氷冷1X PBSで斬首によって安楽死させる。蛍光照明の下で個々に画面には、正のトランスジェニックマウスおよび野生型（WT）非トランスジェニックプールに分割する。解剖を通して氷冷1X PBSで胚を保持します。 </li><li>解剖顕微鏡下では、泌尿生殖器管をサブには、分析する。微細な鉗子と前肢レベルの場所に胚を保持します。その後活発にダウンして離れて背側体壁から内臓を引っ張ってダイアフラムのレベルで鉗子を挿入することによって、性器結核、肝臓から内臓を取り出します。 </li><li>さらに組織をサブ解剖離れて周囲の組織（ 図1）からの関心。氷冷1X HBSSを含む15 mlのコニカルチューブにそれぞれ個別のサブ解剖組織型に配置します。プールの各組織型一緒に胚の表現型に基づいて（ すなわち、すべてのGFP +胎児の腸のサンプルは、単一の15 mlコニカルチューブにプールされています）。 </li><li>並行して、フローサイトメトリーで補償コントロールに使用する野生型胚から同等の組織を分析する。 </li></ol> 3。 Subdissected組織の解離<ol><li>ペレットサブ解剖210相対遠心力（RCF）、4℃で5分間遠心分離による組織。遠心分離後、できるだけ多くのHBSSとしてオフに吸引除去する。 </li><li>組織型の交差汚染を回避するために、各サンプル間のピペットチップを変更している、アキュマックス（革新的なセルテクノロジーズ株式会社）に組織ペレットを再懸濁します。アキュマックス付加価値の量は、組織を大きくしたり小さくしたり額に比例してスケールアップすることができます。通常は1-5胎児の腸のサンプルは、アキュマックスの1ミリリットルが使用されますが、大きな組織のプールは、解離を達成するために大きなボリュームが必要になります。 </li><li>孤立している組織の段階（ 例えば、13.5 DPCの小腸20分、15.5 DPCの小腸35分）に応じて20から45分間、37℃の水浴に場所は、チューブ。途中で解離時間も、手動で水浴（または任意の固体表面）の側面にチューブをノックして（1つは昔ながらの水銀体温計を振るように）チューブを &quot;フリック&quot;で組織を分割します。解離時間の終わりでさらに試料を解離させるプロシージャを複数回シェイクダウンを繰り返します。壊れやすいサンプルについては、シェイクダウンの活力にあふれていることを減らし、代わりに解離の適切なレベルを達成するために、ステップ3.5の間にピペット粉砕を使用しています。 14.5と15.5 DPC DPC LUTの典型的な解離時間はそれぞれ35と45分です。 </li><li>組織はアキュでインキュベートされていますが、焼入れなどを作るlutionsは、と呼ばれるには、急冷し、1:5に急冷。クエンチを6ml L-15メディアに45μlの5 mg / mlのDNase Iを加えることによって行われます。消す1：05を30ml L-15メディアに45μlの5 mg / mlのDNase Iを加えることによって行われます。 </li><li>解離の終わりには、氷の上に15 mlチューブを移動し、直ちに各チューブに1 mlのクエンチを追加します。組織（ 図2）はほぼ完全に解離されるまで上下に各サンプルをひいて粉にする。まだ溶液中に存在する組織のいくつかの小さな塊があるでしょう。それは悪い細胞の生存をもたらすことができるように完全に均質なサンプルを達成することは容易に達成可能でも望ましいものでもありません。 </li><li>プロトコルの残りのためにできるだけ多くのサンプルを氷上に保持します。クエンチをピペッティングあるいはサンプルのクロスコンタミネーションを避けるために、1:5に急冷時に新鮮なピペットチップを使用してください。 </li></ol> 4。細胞懸濁液をフィルタリング<ol><li> 70％エタノールに浸漬された鉗子を用いて、上に38μmのナイロンメッシュ膜の正方形3センチ（Sefarアメリカ）を配置新しい15 mlコニカルチューブの口。ナローボアのヒントを使用して、膜の中心にピペッティングによりメッシュを介してフィルタセル。膜はフィルタリングしながら飽和になった場合は、キムワイプでチューブの口を乾燥させ、それを削除し、細胞懸濁液の残りの部分をフィルタリングするためにナイロンメッシュの新しい部分を使用しています。すべてのセルがフィルタリングされたら、チューブをリンスし、残りの細胞をフィルタリングするために1:5クエンチ1ミリリットルを使用しています。 </li><li>フィルタリングが完了したときや、詰まった膜を交換する場合に、メッシュの側面をロールアップし、細胞のいずれかぶら下がった液滴を除去するためにチューブの上部に膜を拭くために鉗子を使用しています。 </li><li> 210rcf遠心分離によってペレットの細胞懸濁液を、4℃で5分間。 1ミリリットルクエンチ1:5の上清とペレットを再懸濁しをオフに吸引します。 </li><li> 5 mlのポリスチレンチューブにナイロンメッシュを介してフィルタ細胞懸濁液。 1ミリリットルで15 mlチューブを洗浄、1:5およびフィルタは、任意の残りの細胞をキャプチャするために急冷。 </li></ol> 5。 FACSのサンプルを準備<ol&gt; <li>ソートのために、補償のコントロールで同じ組織を使用している場合は、1/10補正コントロールで使用する新しい5 mlのポリスチレンチューブにサンプル量の1/20日に転送されます。二つの部分に野生型の組織サンプルを分割します。後半は7 Aminoactinomycin D（7-AAD、 &quot;染色可能性&quot;として使用される生細胞から除外された蛍光インターカレーター）は7-AADのみ（それに追加されますうちの一方の部分は、（WTのみ）、野生型染色になります。）これらの個々のコントロールは、フローソーターで離散蛍光体の発光の間の任意のスペクトルの重なりの補正を可能にするために必要とされている。例えば、EGFPのような単一の蛍光レポーターのために、必要なコントロールが含まれます：、唯一の染色WT細胞、わずか7-AAD（図3）で染色したチューブをEGFP。 </li><li> 5分間210rcfでクエンチ1:5及び遠心、4°Cで細胞懸濁液を含む全5 mlチューブを埋める。液体の約200μlを残し、上清を吸引チューブインチ</li><li>クエンチ1:5の7-AAD 1:1000に希釈します。 7-AADのみ補償制御とソートするサンプルに7-AAD染色希釈を追加します。 7-AAD EGFPのみ、またはWTのみ補償コントロールに追加しないでください。量得られた細胞ペレットの原料とサイズの量に基づいて異なります追加する7-AAD。 7-AADは、適切なチューブに追加されたら、サンプルでは、​​ソートする準備が整いました。 <table border="1"><tbody><tr><td> 組織 </td><td> サンプル·プール·サイズ </td><td> ボリューム7-AADチューブ*に追加する </td></tr><tr><td> 15.5 DPCの腸</td><td> 1月5日</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> 15.5 DPC LUT </td><td> 1月5日</td><td> 150μlの</td></tr></tbody></table> メディアの吸引であるため、 表1。異なる組織解離し、各チューブ内の*最終的な合計金額に追加された7-AAD量は50μLの範囲の量によって異なります。nプロセス近似し、ペレットを避けるために行った。最終的なボリュームは、溶液中の細胞の処理を最小限に抑えるように測定されていません。 </li><li> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに0.75ミリリットルTRIZOL-LSを追加することにより、RNA分離用の細胞をキャプチャするためにコレクションチューブを準備します。 </li><li>前述のようにin vitro培養用の細胞ではなく、RNAの分離を収集し、直接、6ウェル組織培養プレートで自己複製メディアにソート細胞は、フィブロネクチンでコーティングし、メディアで満たされた場合。2,6,7 </li></ol> 6。フローサイトメトリー<ol><li>フローサイトメーターで、戻って汚染を回避するために、各サンプルの間フラッシュしている、第1の補償を制御し評価する。ソートのために電圧/ゲートを設定するには、補正サンプルのプロファイルを使用します。所望の組織に陽性細胞が数を制限内に存在する場合、異なる組織が蛍光強度と細胞の大きさ限り、補正の設定を確立するために使用できることに注意してくださいサンプル間で同等である。 </li><li> 7-AAD染料を取ると染色コントロール（ 図4）GFP蛍光の相対的な高強度を示す細胞を収集し、死細胞を回避するために、補正パラメータとゲートを設定します。 </li><li>それぞれのマイクロ遠心チューブに最大限に25,000細胞をソートします。ソートは、広い口径ノズルおよび神経前駆細胞の生存を維持するために低流量（ 例えば 、17psi、100μmのノズル、3000イベント/秒）で可能な限り低い圧力で実行する必要があります。 EGFP +細胞を分離するためのソートのために我々は、EGFPレポーターを励起する488nmの20mWをレーザーを用いたBD Biosciences社FACSAriaIIに私たちのアイソレーションを実行します。 </li><li>サンプルは、高細胞濃度が含まれている場合、それがさらに7-AADは、ソートするときに、より高い捕捉効率を達成するために染色1:1000を使用して細胞懸濁液を希釈することをお勧めします。 </li><li>渦すぐにソートされた後TRIZOL-LSに取り込まれた細胞のそれぞれのチューブ。 </li></ol> 7。代表的な結果フローソーティングのための細胞懸濁液を生成するために組織の解離は、適切な酵素消化と低細胞生存率になることが回避、過消化の間の微妙なバランスです。組織解離の所望のレベルの例を図2に示されています。適切に消化された組織でサブ解剖し臓器の手動粉砕片がまだはっきりと明らかになる前に（ 図2b、2F）。酵素的に時間や酵素の高すぎる濃度でも長期間の治療をされる組織では、得られた懸濁液は、組織の残存大部分（ 図2d、2H）を欠いている。 フィルタリング適切な解離とマニュアルは、通常、90％以上の生細胞を示し、EGFPの発現を高レベル（ 図4）を示すフローサイトメトリーでソートプロファイルを生成します。この方法によって得られた細胞集団は良い説明する生存率とは、EGFPのキャプチャ+神経前駆細胞のゲーティングによる遺伝子発現のその後の文化や分析のためにキャプチャすることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> 図1胎児マウスのLUTでTH-EGFP +神経前駆細胞の分布。 15.5 DPCで全体のマウント尿生殖路は蛍光照明（b）に基づき識別TH-EGFP導入遺伝子の発現で標識されたEGFP +細胞の分布と比較して（）の明視野照明の下で腹見た。 TH-EGFPの発現は副腎（a）と内側に位置して腹腔神経節（CG）に存在しています。骨盤神経節（PG）、膀胱壁（BLA）と尿道（U）における導入遺伝子の発現からの蛍光15.5 DPC TH-EGFPサブ解剖膀胱の展示の横方向（c）のビュー。背ビュー（d）にEGFP +細胞は、前方背側尿道に明らかである。その他のラベル：腎臓（K）、精巣（t）は、膀胱（BLA）と性器結核（GT）。 <imgALT = &quot;図2&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; 図2 15 DPC胎児のLUT（a）と腸（e）の明視野画像は、それぞれ、解離のインキュベーションの終わりに、解離の潜伏期間の途中で撮像する前に、マニュアルの中断後の混乱（B、F）、（C、 G）、及び（d、h）を過度に解離されているサンプルインチ<img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> 図3の回路図は、厳しいFACSゲーのパラメータを確立するために必要な補正制御を示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> 図4。14.5 DPC（）と15.5 DPC（B）の流量のソートプロファイルの代表的なイメージ。黒の人口は死んだとによって表記されている前方と側方散乱に基づいて単一の細胞から構成されています7-AAD蛍光。灰色の人口は7-AADを除外したため、実行可能であるた前方及び側方散乱に基づいて一の細胞で構成されています。グリーンゲート人口は箱入りの &quot;GFP +&quot;領域で示されていると7-AADを（生）は除外とEGFP蛍光を示すしている単一の細胞から構成されています。

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

蛍光レポーターを発現するマウスレポーター線は、マウス遺伝学コミュニティ1,8,9の複数の努力を通じて、広く利用可能になっています。結果として、ここで示した解離法が広く、胎児または成体組織のいずれかから神経伝達物質や受容体の発現パターンに基づいて、離散的なニューロンのサブタイプの分離に適用することができます。我々は、蛍光遺伝子レポーターの発現に基づい...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>シグマ（MFR：革新的なセルテクノロジーズ） </td><td> A7089-100ML </td><td> 1mlのアリコートで凍結保管してください</td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td>シグマ</td><td> D-4527 </td><td>保存されている-20℃で凍結1xHBSSのC 5 mg / mlと、 （1:5をクエンチ、クエンチで使用） </td></tr><tr><td> 10×PBSのpHを7.4 </td><td>ギブコ</td><td> 70011-044 </td><td>その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ</td></tr><tr><td> 10X HBSS W / OのCaやMg </td><td>ギブコ</td><td> 14185-052 </td><td>その後、滅菌フィルター組織培養グレードの水で1xにメイクアップ</td></tr><tr><td>リーボビッツのL-15培地</td><td>ギブコ</td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン100X </td><td>ギブコ</td><td>15140-133 </td><td> -20℃でアリコートを格納</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A3912-100G </td><td> -20°C、水中では100 mg / mlになるように分注し、保管する</td></tr><tr><td> 0.85％NaClでのBiowhittaker 1MのHEPES </td><td>ロンザ</td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38μmのNITEXナイロンメッシュメンブレン</td><td> Sefarアメリカ</td><td> 3-38/22 </td><td> 〜3センチの正方形にカット。 UVは、組織培養フード内で殺菌するために一晩処理します。 </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td>インビトロジェン</td><td> A1310 </td><td> 1 mg / mlの</td></tr><tr><td> TRIZOL LS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 mlのポリスチレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlコニカルチューブ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td>細かい解剖鉗子</td><td>ファイン科学·インスツルメンツ</td><td> 11251から30 </td><td>デュモン＃5 Forcep、Dumoxel、標準的なチップ0.1x0.06mm </td></tr><tr><td>解剖スプーン</td><td>ファイン科学·インスツルメンツ</td><td> 10370から18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

開発神​​経堤（NC）に由来神経前駆細胞は、腸と下部尿路のような内臓器官に自律神経節を形成する神経管から移行します。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションのようなメソッドを使用して、離散的集団のその分離は困難であるので、開発時には、成熟した組織の両方でこれらの細胞は、しばしば広く組織全体に分散されています。ただし、これらのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）のようなニューロン特異的遺伝子の調節領域で駆動蛍光レポーターの発現によって直接可視化することができる。我々は可能なTHの高収率+腸解離と蛍光活性化セルソーティング（FACS）に基づいて、下の尿生殖路（LUT）を含む、胎児マウスの内臓組織から神経前駆細胞用に最適化する方法を説明します。 TH遺伝子は、カテコールアミンの生産のための律速酵素をコードしている。腸神経前駆細胞は、TH DURを表現し始める胎児の腸1とTHでの移行をることも大人の骨盤神経節ニューロンの2-4のサブセットに存在しています。この系統の最初の外観と、これらのLUTの他の側面のニューロン、およびその分離の分布が記載されていない。 THを発現する神経前駆細胞は、導入遺伝子コンストラクトのTg（TH-EGFP）DJ76Gsat/Mmnc 1を持つマウスにおけるEGFPの発現により容易に可視化することができる。我々は0.5 DPCとプラグ検出の朝を指定して、15.5日後に性交（DPC）で開発LUTにTHの分布+細胞を記録するために胎児のマウスでこの遺伝子の発現をイメージングし、観察された合体における神経前駆細胞のサブセット骨盤神経節急行EGFP。 LUT TH +神経前駆細胞を単離するために、我々は当初、胎児マウスの小腸2月6日から、神経堤幹細胞を精製するために使用された方法を最適化されています。依拠NC-から派生した集団を単離する前に努力フローサイトメトリー用細胞懸濁液を得るためのコラゲナーゼとトリプシンのカクテルで消化。私たちの手にこれらの方法は、比較的低い生存率LUTから細胞懸濁液を生成した。胎児のLUT組織における神経前駆細胞の既に低い発生率を考えると、我々は、最終的な解離の細胞生存率が増加されるような解離方法を最適化するために設定してください。我々は、私たちは下流の分析のために十分な神経前駆細胞のその後の収率で一貫してより大きな生存率（全細胞の&gt; 70％）を達成することができ、低圧力での並べ替え、その穏やかなACCUMAXで解離（革新的なセルテクノロジーズ株式会社）、マニュアルフィルタリング、およびフローを決定した。我々が記述する方法が広く、胎児または成体マウス組織のいずれかからニューロン集団の様々な分離に適用することができます。

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。

蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K ビュー.  Vanderbilt University School of Medicine. 胎児のマウス組織からの神経堤由来の神経前駆細胞を精製する最適化された手順が記載されています。このメソッドは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって離散的集団を分離するために蛍光レポーター遺伝子からの発現を利用しています。技術が開発を通して、大人の組織から神経細胞集団を単離するために適用することができます。

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Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

神経科学

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

蛍光活性化細胞選別により確立された精製 GABAergic または Glutamatergic ニューロンの初代細胞培養

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.