この作品は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）-CUREセンター、クローン病とアメリカのキャリア開発賞（＃2691）と健康NIDDK K01研究所（DK084256）本町ワイクーンへの資金の大腸炎財団からパイロットとフィージビリティスタディの助成金によって賄われていた。 骨髄照射操作がバーナード·レヴィンとエイズ研究ヒト/マウスキメラ中核施設のためのUCLAのセンターのスコット·キッチンの援助を受けた。フローサイトメトリー操作はUCLAのベクトル·コア施設によって支援された。

1。前あなたスタート技術的な考慮事項<ol><li>対応するCD分子とマウスはマウスの主要ベンダーから購入することができますので、我々は実験のためにC57/BL6野生型マウスとノックアウトマウスの両方を使うことをお勧めします。 </li><li>それは、骨髄移植後の野生型マウスとノックアウトマウス由来のドナー細胞を追跡するのは困難であるので、それは野生型マウスを表すためにCD45.1マウスを使用する必要があります。 （CD45.1 C57/SJL WTマウスジャクソン研究所の株式＃002014）。 </li><li>ほとんどのマウスコロニーがCD45.2です。私たちのノックアウトマウスは、CD45.2遺伝子型（：ジャクソン研究所株式＃000664交互CD45.2 WTマウスソース）に属しています。 CD45.1またはCD45.2遺伝子型の決定は、このプロトコルのセクション7で説明したように、骨髄や末梢血のフローサイトメトリーを用いて行うことができる。 </li><li>照射後のマウスは、免疫力を損なわれている。病原体フリー施設でマウスをおいてください。 </li><li>照射装置の動作は、特別なセキュリティを必要とするclearanceとトレーニング。訓練および承認プロセスに時間を節約するために、それは照射装置を操作することができる資格を持つ技術者による実験室と協力するのが最善です。 </li><li>多くの機関は、経験豊富な技術者とフローサイトメトリー実験室を持っています。フローサイトメトリーの動作に問題を最小限に抑えるために、それはあなたが開始する前に、経験豊富な技術者を使ってフローサイトメトリー実験計画を議論することをお勧めします。 </li><li>マウス（各群10匹）、このように割り当てられていた： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> グループ </td><td></td><td> 受信者への骨髄ドナー </td><td> 治療 </td></tr><tr><td> A </td><td> BMの交換</td><td> CD45.1 WTにCD45.2 KO </td><td> DSS大腸炎</td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td>水の正常なコントロール</td></tr><tr><td> C言語</td><td> BMの交換</td><td> CD45.1 WTにCD45.2 KO </td><td> DSS大腸炎</td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td>水の正常なコントロール</td></tr><tr><td> E </td><td>ごまかし</td><td> CD45.1 WTにCD45.1 WT </td><td> DSS大腸炎</td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td>水の正常なコントロール</td></tr><tr><td> G </td><td>ごまかし</td><td> CD45.2 KOへCD45.2 KO </td><td> DSS大腸炎</td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td>水の正常なコントロール</td></tr></tbody></table>実験プロトコルの*簡単な例を図1に示します。 2。レシピエントマウス照射<ol><li>マウスは飼育と無菌施設に保管されています。フィルタ付きのオートクレーブ処理照射パイでマウスを置きます。照射パイの各スロットに1マウスを置きます。照射器にパイを置き、ターンテーブルとパイが回っていることを確認してください。 </li><li>エアーポンプの電源を入れ換気のために。照射装置のドアを閉じてロックします。 </li><li> 10分（放射線源及び半減期に応じて）約1,000ラド（10グレイに相当）をマウスに照射します。この時点から、放射線照射したマウスは免疫不全で、感染に弱い免疫を持っています。照射後、パイを取り出して、動物施設におけるバイオセーフティキャビネットへの輸送のための無菌の容器に入れる。感染の機会を最小限にするために外部環境にマウスを近づけないようにしてください。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内で、（ - 水100ml当たり3.12ミリリットルをケージあたり4匹sulfatrim懸濁液と新しい滅菌水を追加）オートクレーブした寝具を使用してオートクレーブしたマウスのケージにマウスを移す。 </li><li>抗生物質は光感受性であるためアルミホイルで水のボトルを包む。ケージにそれをロードする前によくsulfatrimソリューションボトルを混ぜてシェイク。 </li></ol> 3。ドナー骨髄の抽出<ol><li>二酸化炭素またはisoflur持つマウスを生け贄に捧げるインピーダンスその後1:200ライゾール溶液中に浸す。肌を濡らし、オープン骨を切開し、70％エタノールでマウスをスプレーしてください。 </li><li>滅菌のための70％エタノール中で解剖器具を浸す。 </li><li>バイオセーフティキャビネット内郭清を行う。筋肉や靭帯を取り付けるから無料上腕骨、大腿骨、脛骨と腓骨の骨を露出させ、無菌の解剖器を使用します。 </li><li>赤色骨髄を表示するために骨の両端を切り開く。ピンセットで骨を保持します。シャーレに3mlの注射器と25G針で冷PBSで赤色骨髄を洗い流す。より骨髄細胞を生成するために骨の両端からフラッシュします。 </li><li>繰り返し吸引と吐出によって赤色骨髄プラグを壊すために6ミリリットルのシリンジと18G1 / 2の注射針を使用しています。 50mlのFalconチューブで骨髄を転送します。 </li><li> 4℃で5分間のために1800回転で骨髄をスピンダウン5から10秒間ボルテックスすることにより上清、ペレットを再懸濁しを破棄します。 </li><li>滅菌水で10倍のRBC溶解緩衝液で希釈します。広告D 1X RBC溶解バッファー（ドナーマウスあたり5ml）、5秒間再びボルテックスし、室温で正確に3分間保つ。 </li><li> 3分後、溶解及び混合を停止するには、20ミリリットル冷PBSでチューブを埋める。新しい50mlファルコンチューブに直接40μmのセルストレーナーを介してコンテンツを注ぐ。 </li><li> 5mlのPBSで元のチューブを洗浄し、同様にセルストレーナーに転送されます。 PBSおよびミックスで50mlに水を補充して下さい。 </li></ol> 4。骨髄ドナー細胞をカウント<ol><li>エッペンドルフチュー​​ブ、エッペンドルフチュー​​ブとミックスに骨髄懸濁液100μlにトリパンブルーの100μlを添加する。血球計数器に染色された細胞混合物をピペット。 </li><li>細胞の量は、16の正方形でファルコンチューブ=非染色細胞数×2（トリパンブルーの希釈に起因する）×10,000×50ミリリットルの総リビング骨髄細胞数によって計算され</li><li> 4℃で5分間、2,000 rpmで50ミリリットルのファルコンチューブに骨髄細胞をスピンダウン</li><li>上清を取り除きます。基づい総細胞数で、1mlあたり1×10 8個の細胞をPBSでペレットを再懸濁</li></ol> 5。レシピエントマウスに注入<ol><li>熱パッド上と温暖ランプの下で、レシピエントマウスを温める。拘束中のレシピエントマウスを置きます。静脈内に100から200μlにマウスあたり1×10 7個の細胞を注入します。 </li><li>ドナー骨髄の注入は、照射後4から24時間の間に行わなければなりません。 </li><li>ケージあたり4注射したマウスについていく。病原体フリー動物施設の最初の4週間の抗生物質で処理した水を用いてオートクレーブしたケージの中に注入されたレシピエントマウスを維持し、マウスは免疫力を取り戻すことができます。衛生状態を維持するために4日毎にはケージ、抗生物質で処理した水や食料を変更します。 </li></ol> 6。大腸炎や大腸炎の評価の誘導<ol><li> 4週間照射と骨髄移植後に、それらの正常を取り戻すために抗生物質を含まない通常の水に切り替えて、さらに2週間のマウスを維持叢を腸。 </li><li> 6週間骨髄注入後、初期の体重を測定します。いくつかのマウスは大腸炎を誘発するために水を自由に摂取を飲んで5％硫酸デキストランを与えられている。一部のマウスでのみ正常対照群として定期的な飲料水を与えられている。 </li><li> 5日後、末梢血を撤回し、ヘパリンコーティングチューブ（バキュテイナー）に転送して、氷の中に保管してください。 1チューブに4匹から血液をプール。 =600μlの細胞染色バッファ300μlの血液300μlのを兼ね備えています。 100μlで5エッペンドルフチュー​​ブ、それぞれに血を分けてください。 </li><li>二酸化炭素又はイソフルランを持つマウスを生け贄に捧げる。巨視的な損傷のスコア（詳細1のための別のJOVEビデオ出版物を参照してください）を評価します。体重変化を測定します。デジタルキャリパーと腸の長さと厚さを測定します。スツールテクスチャを（ハード、ソフトや血）に従ってください。 Hemooccultと便中の潜血を決定します。結腸組織を解剖し、H＆E染色のためにホルマリンで固定します。 </li><li> 1大腿boを解剖するね当たりマウスは、骨髄を​​抽出し、25G針と1mlシリンジ経由冷PBSで骨髄をフラッシュします。プール4骨髄は1管に差し込むと、氷の中に保管してください。 </li><li>全く骨髄プラグが存在しなくなるまでペトリ皿、せん断18G針と5mlシリンジで数回骨髄プラグに骨​​髄を注ぐ。 </li><li> 4℃で5分間1500 rpmでスピンダウン上清を除去し、600μlの細胞染色バッファーで再懸濁する。 100μlで5エッペンドルフチュー​​ブ、それぞれに再懸濁させた骨髄を分ける。 </li></ol> 7。フローサイトメトリーによる骨髄移植の品質検査<ol><li>血液や骨髄＃1-5の各サンプルチューブにラベルを付ける： </li><li>暗闇の中で、それぞれの管のための抗体混合物を準備します。 </li></ol>第1抗体なし 第230μlのFITCアイソタイプコントロール+30μlのPEのアイソタイプコントロール+15μlのCD16/32ブロッキング 第330μlのFITC CD45.1 AB +15μlのCD16/32ブロッキング ＃4を30μlのPECD45.2 AB +15μlのCD16/32ブロッキング 第530μlのFITC CD45.1 AB +30μlのPE CD45.2 AB +15μlのCD16/32ブロッキング<table border="1"><tbody><tr><td>血液や骨髄のサンプル＃1には何も追加しない</td></tr><tr><td>各血液または骨髄サンプル＃2への抗体混合物＃25μlを追加</td></tr><tr><td>各血液または骨髄サンプル＃3に抗体混合物＃3の3μlを加え</td></tr><tr><td>各血液または骨髄サンプル＃4に抗体混合第43μlを追加</td></tr><tr><td>各血液または骨髄サンプル＃5への抗体混合物＃5μlを加え</td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 30分間氷上で、暗所で保管してください。 </li><li>各チューブに2ミリリットル1X RBC溶解バッファーを追加します。氷上で15分間、暗所で保管してください。 </li><li> 4℃で5分間、1500rpmで細胞をスピンダウン（GH 3.8ローター、1,500回転= 350×g）で上清を除去します。暗い、その後渦簡潔で500μlの細胞染色バッファーでペレットを再懸濁します。 </LI&gt; <li>フローサイトメトリーによる免疫染色された血液や骨髄サンプルでCD45.1（WTを表す）とCD45.2を（KOを表す）を確認してください。 KO CD45.2を表すために、WT CD45.1とPEを表すためにFITCを選択します。 </li><li> FlowJoソフトウェアによってフローサイトメトリーの結果を分析します。ドナーの遺伝子型は、血液や骨髄中の支配的な遺伝子型であるかどうかを判断するのFITC比：PEの比、またはPE：FITCの比率を計算します。 </li></ol>

<ol>
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Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li><li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice:+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li><li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice.">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li><li>Lee, C. 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Pathol. 64, 771-775 (2011).</li><li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow-derived+monocytes/macrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and/or+anticancer+drugs+in+colitis+model.">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).</li><li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+.">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. .</a> Gut. , (2012).</li><li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14++monocytes.">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この骨髄移植のアプローチは、大腸炎の免疫学研究、感染症、癌、肥満や他の病気のために適している。この骨髄移植実験は、目的遺伝子が両方の骨髄由来と非骨髄由来細胞と目的遺伝子がいずれの集団からの細胞によって病気を媒介することが疑われるで発現した場合に必要とされる。例えば、抗菌ペプチドカテリシジンは、急性大腸炎を調節することが示されている。しかし、それは、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>細胞染色バッファ</td><td> Biolegend </td><td> ＃420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC溶解バッファー</td><td> Biolegend </td><td> ＃420301 </td></tr><tr><td> FITC標識マウスアイソタイプコントロール</td><td> Biolegend </td><td> ＃400207 </td></tr><tr><td> PEのマウスアイソタイプコントロール</td><td> Biolegend </td><td> ＃400211 </td></tr><tr><td> PE抗マウスCD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> ＃109807 </td></tr><tr><td> FITC抗マウスCD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> ＃110705 </td></tr><tr><td>抗マウスCD16/32ブロッキング</td><td> Biolegend </td><td> ＃101301 </td></tr><tr><td> 40μmのセルストレーナー</td><td> Fisherbrand </td><td> ＃22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tD&gt; MPバイオメディカル</td><td> ＃1860454 </td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Fisherbrand </td><td> ＃BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim（SMZ） </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720（漁師） </td></tr><tr><td>ライゾールIC </td><td> Andwin科学</td><td> NC9745686（漁師） </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> ＃8000813 </td></tr><tr><td>マウス制止</td><td>トリーサイエン</td><td> ＃テレビ-150 </td></tr><tr><td>照射器</td><td> JLシェパード·アンド·アソシエイツ</td><td>私は68Aマーク</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td>フローサイトメーターの試験管</td><td>ファルコン</td><td> ＃352052 </td></tr><tr><td>デジタルノギス</td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td>ヘモカルトICT </td><td>ベックマン·コールター</td><td> G0328QW </td></tR&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

大腸炎の開発における遺伝子の役割を理解するために、我々は、野生型マウスと大腸炎に目的遺伝子欠損ノックアウトマウスの応答を比較した。目的遺伝子は、骨髄由来の細胞とホストの非骨髄由来細胞の両方で発現される場合、ただし、それは、骨髄由来の細胞と非骨髄に目的の遺伝子の役割を区別することが可能である骨髄移植技術によって誘導された細胞。マウスの骨髄由来細胞の遺伝子型を変更するには、レシピエントマウスのオリジナルの骨髄を照射して破壊され、その後、別の遺伝子型の新しいドナー骨髄に取って代わられた。野生型マウスのドナー骨髄をノックアウトマウスに移植したとき、我々は骨髄由来の細胞における野生型遺伝子の発現とノックアウトマウスを生成することができます。あるいは、時のノックアウトマウスドナー骨髄は目的遺伝子を発現せず、野生型レシピエントマウスは、野生型マウスに移植した骨髄由来の細胞を作製した。しかし、骨髄移植は100％完全ではありません。そこで、レシピエントマウスと骨髄移植の成功におけるドナー骨髄由来の細胞の割合を追跡するために、ドナーとレシピエント細胞のマーカーとして分化（CD）の分子のクラスタ（CD45.1とCD45.2）を利用。 CD45.2遺伝子型を持つCD45.1遺伝子型とノックアウトマウスと野生型マウスを用いた。レシピエントマウスの照射後、異なる遺伝子型のドナー骨髄細胞をレシピエントマウスに注入した。新しい骨髄がその免疫を引き継ぐために再生したときに、マウスは大腸炎を誘導する化学剤（デキストラン硫酸ナトリウム、DSSの5％）でチャレンジした。ここで我々はまた、マウスでは大腸炎を誘導し、骨髄由来の細胞から発現対象の遺伝子の役割を評価するための手法を示した。骨由来の細胞から目的遺伝子は、疾患の発症に重要な役割を（例えば大腸菌などに再生される場合TIS）、骨髄移植によるレシピエントマウスの表現型を大幅に変更することができます。大腸炎の実験の最後に、血液や骨髄中の細胞を骨髄由来がCD45.1とCD45.2に対する抗体と存在の彼らの量的比率を用いて標識したフローサイトメトリーにより、骨髄移植の成功を評価するために使用することができる。成功した骨髄移植はレシピエントマウスの骨髄や血液の両方で受信者の遺伝子型以上のドナー遺伝子型（CD分子マーカーの任期で）の大半を示すべきである。

目的遺伝子は、大腸炎の開発の間に免疫細胞で重要な役割を果たしている場合には、骨髄を​​介して異なる遺伝子型の骨髄を受けたマウスは、移植（KOまたはKOにWTとWTは）DSS大腸炎への応答変化があるはずです。大腸炎の重症度を決定するための最も重要なパラメータの1つは、結腸組織のH＆E染色である。結腸組織構造の変化や炎症の徴候を定量的に、H＆E組織像のスコアリングシステムで...

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髄移植は、骨髄由来細胞の遺伝子型を変更する方法を提供します。目的の遺伝子が骨髄由来細胞と非骨髄由来細胞の両方で発現されている場合は、骨髄移植では、非骨髄由来細胞の遺伝子型を変更することなく、異なる遺伝子型に骨髄由来細胞を変更することができます。

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K ビュー.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. 骨髄移植は、骨髄由来細胞の遺伝子型を変更する方法を提供します。目的の遺伝子が骨髄由来細胞と非骨髄由来細胞の両方で発現されている場合は、骨髄移植では、非骨髄由来細胞の遺伝子型を変更することなく、異なる遺伝子型に骨髄由来細胞を変更することができます。

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

免疫・感染学

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

移植片対宿主病における樹状細胞の役割を調べる骨髄移植プラットフォーム

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...