微速度顕微鏡観察実験で、生体分子スクリーニング施設 (BSF)、スイス連邦工科大学に行った。ありがとう Marc Delachaux (視聴覚サービス、スイス連邦工科大学)、ビデオ撮影と映画の編集します。

注: この研究で E14 ES 細胞ラインが使用されました。しかし、このプロトコルは、他のスナップ タグ内因性のタンパク質のタグ付けまたは過剰発現による融合した興味の蛋白質を表現するマウス ES 細胞ラインには直接適用。結果のセクションで示した例では、ドキシサイクリン誘導スナップ タグ融合細胞は使用された (次の蛋白質に融合したスナップ タグ: Nanog、Oct4、Srsf11、または蛍光タンパク質 mOrange2 と sfGFP の制御下に置く、ドキシサイクリン誘導型プロモーター。詳細については、11の参照ドキシサイクリン誘導スナップ タグ融合細胞の生成に使用されるプラスミド)。ドキシサイクリン誘導システムは、それのタイミングおよび興味の蛋白質の表現の強さを厳しく制御することができ便利なすることができます。C 末端がスナップ タグの位置決めをお勧め、N 末端を変更するアミノ酸配列はターゲット蛋白質 (N 末端規則12) の半減期を変更する可能性が高い。
1. E-カドヘリン コーティングと細胞の播種
<ol><li>スナップ タグ4に融合した興味の蛋白質を表現する ES 細胞ラインを生成します。</li>
	<li>コート 100 mm 細胞培養皿 4 ml の 0.1% ゼラチン (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +/Mg2 +なしで希釈) 1 h. のためのゼラチンを削除させてすぐに 1 h. の使用のための乾燥や最大 2 ヶ月間コーティング料理を保存します。</li>
	<li>ES 細胞培養培地 (グラスゴー最小値必要な媒体、10 %es 細胞修飾ウシ胎児血清 2 mM ピルビン酸ナトリウム、1% 非本質的なアミノ酸、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM 100 μ M 2-L-グルタミンを添加した興味の細胞ラインを育てるメルカプトエタノール、白血病抑制因子 (LIF) 3 μ M CHIR99021 0.8 μ m PD184352) ゼラチン コーティング料理皿あたり 10-20 美緒セルの合流点に到達するまで 2 日間の CO2を 37 ° C、5% に。 注: ここでは、LIF は HEK 293 t 細胞、培養上清のコレクションが続くし、フィルタ リングのトランスフェクションによって製作されました。LIF の各バッチはその潜在的な多能性を維持するためにテストされたが、濃度が定められなかった。ただし、組換え LIF は市販されても、マウス ES 細胞培養の一般的に使用される濃度は 1000 単位/ml13。</li>
	<li>コートの 96 ウェル プレートに適したイメージング遺伝子組換えマウスの 30 μ L と E-カドヘリン Fc キメラ蛋白質 (E-cad-Fc)/ウェル (5 ng/μ L、Ca2 +/Mg2 +で PBS で希釈しました。ストック濃度 100 ng/μ L、-80 ° C で保存を使用)。E-cad-Fc は非常に壊れやすいので広範なピペッティングを避けてください。1.5 h の 37 ° C で孵化させなさい。 注: 顕微鏡によって他の形式を使用する場合があります。</li>
	<li>電子 cad Fc を吸引、Ca2 +/Mg2 +で 100 μ L の PBS で 1 回洗浄し、予め温めておいた ES 細胞培養液 100 μ L を追加します。</li>
	<li>5 ml の PBS の Ca2 +/Mg2 +なし興味のセルを洗浄します。吸引し、0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL を追加します。37 ° C で 4 分間インキュベートします。ES 細胞培養培地 4 mL を追加、再懸濁します、1000 x g で 4 分間吸引上澄みでスピンダウンし、新鮮な ES 細胞培養培地 2 mL にペレットを再懸濁します。 注: Ca2 +/Mg2 +なし PBS は trypsinization の前に細胞を洗浄するため細胞接着に必要な Ca2 +イオンを除去するために使用ください。対照的に、E-cad-Fc 希釈とコーティング (手順 1.4)、PBS を使用して、Ca2 +/Mg2 +E-cad-Fc に ES 細胞の接着からコーティングされた料理は Ca2 +-依存14。</li>
	<li>再懸濁細胞 1:10 ES 細胞培養培地とカウント、カウント商工会議所 (商工深さ 0.1 mm のロード 10 μ L) を使用しての 1 つの mL で希釈します。</li>
	<li>種 30,000 セル/cm2 E cad Fc では、イメージング プレートをコーティングしました。ES 細胞培養培地で最大 200 μ L/ウェルを埋めます。ドキシサイクリン誘導性細胞の誘導ドキシサイクリンの適切な投与量と (線量と事前に誘導のタイミングを最適化します。ここで使用される細胞がドキシサイクリンで治療 500 ng/mL イメージングの前に 24 h)。37 ° C、5% CO2で孵化させなさい、パルス ラベリングと細胞播種後 24 h の画像に進みます。</li>
</ol>2. パルス スナップ タグのラベルを付ける
メモ: タンパク質崩壊実験は適切なスナップインの色素の濃度を使用することが重要です。濃度は、コマ撮りの初めに明るい信号を生成するために十分に高くする必要があります、蛍光性は時間とともに減少します。しかし、あまりにも高い染料濃度を使用して残留色素媒体またはセルを洗濯後も残されて可能性があります。自由な染料その後減衰曲線を歪曲映画のコースを新しく作り出されたスナップ タグ分子をバインドしました。観測された蛍光シグナルは染料、セルラインを使用する、対応するタンパク質の発現レベルのプロパティによって異なります。したがって、製造元が生きているセルイメージ投射の推奨希釈から始まって、異なる希釈率をテストすることによって色素の濃度を最適化することが重要です。本研究では, 遠赤色蛍光基板使用しています。12 の最適濃度 nM ドキシサイクリン誘導発現細胞決定されました。
<ol><li>予め温めておいた ES 細胞培地の濃度を適当にスナップの色素を薄くしなさい。以前 96 ウェル プレートに播種された細胞からメディアを取り除きます、ピペットを使用し、50 μ L/ウェル スナップ色素希釈を追加します。37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>ピペットと色素の希釈を吸引、(せずに Ca2 +/Mg2 +) に予め温めておいた PBS の 200 μ L で 3 x を洗ってください。ES 細胞培養液 200 μ L を追加し、37 ° C で 15 分間インキュベート</li>
	<li>さらに 2 回前の洗浄手順を繰り返します。 メモ: 広範な洗浄は、非連結の色素を除去するために重要です。PBS で繰り返し洗浄のステップは、15 分孵化イメージングの実験を開始する前にスナップ-タグ融合タンパク質の堅牢なラベリングを確保するのに対し、中で残留細胞外の染料を削除します。しかし、穏やかなピペッティングして洗浄手順を実行、E-cad-Fc に播種された細胞は簡単に切り離す傾向があるので、自動吸引器を使用しないでください。</li>
	<li>画像中の 200 μ L を追加します。1% ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、100 μ M 2-メルカプトエタノール、LIF、3 μ M 1% 非本質的なアミノ酸、2 mM ピルビン酸ナトリウム 10 %es 細胞修飾ウシ胎児血清 (補足蛍光バック グラウンドを減らす、フェノールレッドの自由な媒体を使用するにはCHIR99021 と 0.8 μ M PD184352)。</li>
</ol>3. 微速度顕微鏡観察
<ol><li>CO2温度制御ができ、ライブ イメージングに適した顕微鏡を使用します。37 ° C、5% CO2温度設定使用し、1-2 h の平衡に許可する前に。</li>
	<li>顕微鏡にプレートを置き、撮影に適した場所を見つけます。セルの均等に分散、しかし余りに密、これは解析を促進するとスポットを選択します。分析に必要なセルの数を選択したスポットの数を調整します。本研究では細胞あたり 3-5 点を記録しました。</li>
	<li>目的を選択します。20 × 対物は ES 細胞のサイズに適しています。</li>
	<li>記録される蛍光チャンネルのイルミネーションの設定を選択します。レーザーの出力と興味の細胞からの蛍光信号の強度に応じて露出を調整します。それは、映画のコース上の減少がレーザー光毒性と退色を最小限にするために 30% 以上を避けるために強い最初の信号を取得することを確認します。本研究では、632/22 の励起フィルターの nm (波長/帯域通過)、679/34 の排出フィルター nm (波長/帯域通過)、レーザー出力の 10% と露出時間が 100 ms に使用されました。</li>
	<li>イメージングの間隔とタイムラプスの実験の期間を選択します。予想される半減期 2-20 h が付いている蛋白質、15 分の時間間隔に 12-24 時間の集録時間を選択します。短い寿命の蛋白質、それに応じて時間間隔および長寿命の蛋白質の増加のための取得時間を減らします。</li>
	<li>イメージングを開始します。</li>
</ol>4. 画像処理と解析
<ol><li>Tiff 形式でスタックとして取得した画像を収集します。さらに処理と解析、フィジー ソフトウェア15を使用します。顕微鏡のソフトウェアでスタックとして時間経過データを収集しない場合、は、ソフトウェアでタイムラプスの実験のすべてのフレームを開きます (いずれかのファイルをクリックして |開く.またはドラッグ アンド ドロップ ツールバーに対応するファイル)画像をクリックして |スタック|画像をスタックします。</li>
	<li>スタック内のすべての画像から背景を削除するのに減算バック グラウンド関数を使用します。これを行うには、[プロセス] をクリックして |背景を減算します。ポップアップ ウィンドウでローリングの球の半径を選択します。イメージ セルのサイズは、少なくとも半径を使用します。背景差分をスタック内のすべてのセルに適用する選択はいプロセスのスタック?ポップアップ ウィンドウ。</li>
	<li>興味のセルを選択し、ツールバーを使用してそれのまわりの利益 (率 ROI) の領域を描画します。核の信号最初ツールバーの対応するタブをクリックして、クリックして関心の核に調整それのまわりの楕円楕円形選択範囲を使用します。細胞質信号または非常に密集した地域密接にセル アウトラインに従うようにするフリーハンドの選択を使用します。背景のあまりにも大きな領域を含むを避けるため、にもかかわらず、すべてのバック グラウンド ピクセル (ステップ 4.8 4.9) その後減算により正確にセル アウトラインに従う必要はありません。</li>
	<li>分析をクリックして関心領域を ROI マネージャーに追加 |ツール |ROI マネージャー |追加、またはキーボードのTを押すことによって。</li>
	<li>履歴ウィンドウにタブを移動することによってまたは shift キーを押すことで次のフレームに進む + < キーボードの前のアクションを繰り返します。次の映画のコースを通して興味のセル、フレームごとの ROI を ROI マネージャーに追加します。最終的な ROI の詳細] をクリックして履歴の各セルの設定を保存 |保存. で ROI マネージャー。 注: 両方の娘細胞を個別に追跡、細胞の分裂後、バック グラウンド減算後の積分強度を合計 (4.6 4.9 の手順を参照) 細胞分裂時にタンパク質の希釈を考慮します。両方の娘細胞の ROI 設定を保存します。</li>
	<li>映画を通して興味のセルを追跡、測定、平均強度と Roi の領域の値を取得するをクリックします。電子スプレッドシート プログラムに得られた値をコピーし、各時点の生セルの強度を次のように計算。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> 場所意味するc平均強度と領域C対応する ROI の領域。</li>
	<li>ローカルの背景を見積もるには、各時間フレームのための興味のセルの近くに投資収益率を追加します。任意細胞蛍光信号を含めないようにします。セルのサイズは、ほぼ円形の投資収益率を使用して、移動または場合は隣接セル干渉する場合など、必要に応じてそれを縮小します。背景の投資収益率を得るために設定 ROI 設定携帯電話前述を進み強度値をワークシートにコピーします。</li>
	<li>セルの統合された強度のバック グラウンド補正値を得るためには、まず各時点のバック グラウンドの強度を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> バック グラウンド信号とC領域の平均強度BGを意味するが、セルを取り囲む ROI の領域です。両方の領域は、同じサイズを持っている場合を除き、投資収益率、背景色の部分を使用しないでください。</li>
	<li>時期ごとのセルの最終的なバック グラウンド減算統合された強度を計算します。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>単一のセルの減衰曲線を正規化するには、最初の時間点の輝度値によって各時点の強度の値を分割します。 注: 曲線のあてはめ (4.11 のステップを参照) 実行できます各単一セルまたは人口平均。国交正常化は、細胞間の異なる蛍光強度からバイアスを避けるために、母集団の平均を計算する場合に必要です。国交正常化では、各セルが最終的な減衰曲線を同じ重さで寄与しているように。また、国交正常化は、(図 3 a-3 Cを参照)、絶対蛍光強度とは関係なく単一細胞崩壊を視覚化するのに役立ちますすることができます。ただし、場合にのみ単一セルの半減が決定され、データは平均化されません、正規化ステップは省略できます、曲線のあてはめは raw データで直接実行できます。</li>
	<li>タンパク質の半減期の推定曲線のフィッティング ツールを使用します。この研究では、既定では MATLAB のユーザー インターフェイスの [アプリケーション] セクションにある MATLAB ツールボックス 3.4.1 カーブフィッティングは使用されました。蛍光強度をインポートし、MATLAB に電子スプレッドシートデータのインポートタブをクリックしてから時刻値カーブフィッティング ツールボックスを開き、 X データとY の時間ポイントと蛍光減衰データを選択データでフィット カーブ選択カスタム式] タブ] タブし、指数関数的減衰の式を入力します。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f(t)は与えられた時点での蛍光強度が、初期強度とb減衰率。フィット オプション] タブ、両方aとbの下限の 0 を選択します。Aとbの推定値は、[結果] ウィンドウに表示されます。半減期を次のように計算します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. 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最も重要なステップ、残留非連結色素が残っていないか確認培地でも細胞としてそれ以外の場合は、洗浄後それを可能性がありますにバインド新しくスナップ タグを使用して蛋白質の腐敗を監視する、生産実験とそこの間に後でスナップ タグ分子イービ減衰曲線を危険にさらします。これは慎重に記載されている洗濯のすべての手順を実行することによって達成される 1 つの手です。その?...

細胞蛋白質が合成と分解率の各蛋白質の生理学的規制の対象は特定されている広範な売り上げ高を受けることが知られています。従来、蛋白質分解率は測定された放射性パルス追跡分析など、一括方法またはタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド1などを含むされています。最近では、地球規模2タンパク質代謝回転を定量化する安定同位体標識質量分析法との組み合わせで細胞培養 (SILAC) のアミノ酸と定めております。これらのメソッドは、人口の平均によって制限され、細胞間の変動についての情報が失われるため。さらに、細胞集団間で非同期タンパク質分解の一時的な変更を識別できません。
また、タンパク質の半減は、蛍光ベースのアプローチは、多くの場合単一セルの解像度を提供することの利点があるによって決定することができます。たとえば、活性型緑色蛍光タンパク質 (paGFP) は、初期の哺乳類の胚3Oct4 半減期を決定するため使用されています。細胞内タンパク質崩壊を監視する別の方法は、蛍光タイムラプス イメージングとの組み合わせでスナップ タグの使用です。スナップ タグは変異 DNA 修復酵素 O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) 特に (BG) 誘導体、分子プローブ4,5,に結合することができます benzylguanine と反応して、バージョン6。 したがって、任意のスナップ タグ融合タンパク質が不可逆的蛍光、細胞透過性色素をラベルすることができます。パルスが残留色素の流失が続くスナップ タグに融合した興味の蛋白質の分類の分類された蛋白質の人口の低下を監視され、そのタンパク質の半減期を求めることができます。スナップ タグは正常にパルス追跡は蛋白質の分類に使用されている、タンパク質を決定するため半減付着細胞文化とin vivo5,7,8,9。一般的に使用されるカバー スナップ タグ基板の大規模な様々 な蛍光スペクトル、市販、特定のアプリケーションに対して最適な染料の選択を有効にします。したがって、スナップイン タグは、他の蛍光融合タンパク質や色素と組み合わせてマルチカラー イメージングを使用もできます。細胞不透過性色素は、細胞膜透過性の色素が細胞内と膜結合タンパク質のモニタリングに適用、つなが膜蛋白質の分類に適しています。さらに、これらのプローブのいくつかはほとんどない基底の蛍光を展示し、スナップ タグ10へのバインド時に強力な蛍光信号を発光のみで開始。
このプロトコルでは、スナップ タグを使用して単一セルの興味の異なった蛋白質の分解速度を測定する方法について説明します。ここでは、E-カドヘリンの培養マウス胚性幹 (ES) 細胞に本手法を適用が、付着性の培養されたセルの任意の型を使用する可能であるべきです。示すパルス標識蛍光タイムラプス イメージング続いてスナップ タグ融合タンパク質の興味の様々 な蛋白質の 1 つのセルの半減を決定することができます半減の細胞間の可変性の見積もりを提供します、培養細胞の人口。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Equipment</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td>
			<td style="width:189px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td>
			<td style="width:189px;">Marienfeld-superior</td>
			<td style="width:119px;">640030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Panasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Centrifuge 5804 R</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td>5804000528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td>
			<td style="width:189px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Reagents</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">113-24-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Minimum Essential Medium&#160; Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">4-01F00H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Leukemia Inhibitory factor</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td>
			<td style="width:189px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">361559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">PD 0325901</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">391210-10-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Gelatin from bovine skin</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS 10x concentrated</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05K00-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Dulbecco&#39;s PBS Without Ca++/Mg++</td>
			<td style="width:189px;">BioConcept</td>
			<td style="width:119px;">3-05F29-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td>
			<td style="width:189px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">748-EC-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">SNAP-Cell 647-SiR</td>
			<td style="width:189px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">S9102S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FluoroBrite DMEM</td>
			<td style="width:189px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name</td>
			<td style="width:189px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Software</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">FIJI</td>
			<td style="width:189px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>Open-source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">MATLAB R2014a</td>
			<td style="width:189px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:189px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

タンパク質合成の動的な状態で、劣化と半減を様々 な状況下で調整できます。しかし、最もよく使われるアプローチ タンパク質の半減期を判断するには、いずれかにタンパク質合成阻害剤の使用を必要とするまたは分離細胞から人口平均に限定。このプロトコルでは、測定蛋白質半減単一接着細胞、内スナップ タグ融合タンパク質を蛍光タイムラプス顕微鏡と組み合わせて使用する方法について説明します。スナップ タグに融合した興味のすべての蛋白質は、benzylguanine 誘導体に蛍光、結合は細胞透過性色素による共有結合することができます、残留色素のウォッシュ アウト後の分類された蛋白質の人口の崩壊を監視できます。その後細胞を追跡および曲線当てはめによる単一細胞における蛋白質分解率の決定を可能にする履歴セルごとに指数関数的減衰曲線の時間の結果の統合の蛍光強度の定量化。このメソッドは、他の方法で評価することはできません簡単に培養細胞の人口の半分の生活の不均一性の推定値を提供します。ここで紹介した方法は、スナップ タグに融合した興味の蛋白質を表現する培養された付着性のセルの任意の型に適用されます。ここで E カドヘリン被覆細胞培養皿上に成長したマウス胚性幹 (ES) 細胞を使用してどのように単一電池の劣化によりタンパク質の半減の広い範囲で料金を定めることができるを示します。

記述のプロトコルは、スナップ タグに融合蛋白質の半減期で細胞間の可変性の見積もりを提供します。イメージング プレートのコーティング用組換え E-カドヘリン - fc 使用できますそれ以外の植民地に自生する ES 細胞の単一セルの解像度。単一のセルは、映画 (図 1 a) のコースを通して個別に追跡できます。
各単一セルの蛋白質の半減期を決定す...

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Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

このプロトコルでは、蛋白質半減単一接着細胞、パルスのラベリングとスナップ タグ融合タンパク質の蛍光タイムラプス イメージングを使用してを決定する方法について説明します。

単一細胞付着性細胞培養のタイムラプス蛍光顕微鏡による蛋白質分解率の定量化

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K ビュー.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). このプロトコルでは、蛋白質半減単一接着細胞、パルスのラベリングとスナップ タグ融合タンパク質の蛍光タイムラプス イメージングを使用してを決定する方法について説明します。

ビデオ: Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

発生生物学

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...