この作品は、医学研究評議会とマリー·キュリー国際社会復帰グラント方式（JKVへ）によってサポートされていました。

1。 cDNA発現クローンをピッキング<ol><li> cDNAライブラリーは、96ウェルフォーマットでグリセロールストックの単一の細菌クローンとして提供されています。 Norgen CP7200のピッカーメニューでRearrayコマンドを使用して、96ディープウェル（井戸1ミリリットル）をプレートに1.5 mlのLB /アンプにソースプレートや接種から細菌クローンを選択します。 </li><li>ガス透過性のシールでディープウェルプレートを密封し、振とう機で37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol> 2。 cDNA発現ライブラリーの作製<ol><li>テーブルトップ遠心機でプレートアダプタを使用し、20分間2,000 rpmで細菌を含むディープウェルプレートを回転させます。 </li><li>細菌ペレットをそのまま残して、ウェルから培地を吸引。 </li><li> 図2に示すように、ラボ·オートメーション·ワークステーションのデッキを構成します。プラスミド調製用の溶液はトラフ1月5日に配布されており、ディープウェルプレートはデッキ上に配置されます。溶出溶液によるマルチウェルトラフディープウェルプレートに隣接して配置される。ヒントはチップラックにロードされます。 </li><li>真空マニホールドを組み立てます。プラスミド結合プレートはマニホールドの内部に配置され、プラスミドフィルタープレート、マニホールドの上に配置されます。 </li><li>ピペッティングにより250μlの溶液1（再懸濁緩衝液）でペレットを再懸濁します。 </li><li> 250μlの溶液2（溶解バッファー）を添加することにより細菌を溶解します。プレートを密封し、完全な混合を可能にするために反転されます。 </li><li> 2分のタイマーを起動します。 </li><li> 350μlの溶液3（中和バッファー）を追加します。プレートをシールし、3回転倒。 </li><li>プラスミドフィルタープレートに細菌溶解物を転送します。 </li><li> 5分間吸引してください。 </li><li>フィルタープレートを取り外し、マニホールドの上に結合プレートを配置します。 1分間吸引してください。 </li><li>追加の洗浄（AW）のバッファー500μlを加える。 </li><li> 2分間吸引してください。 </li><li>洗浄緩衝液4の900μlを添加する。 2分間吸引してください。 </li><li>繰り返しの2.14 TEP。さらに15分間吸引してください。 </li><li>マニホールド内のDNAコレクションプレートを置きます。結合プレートに溶出バッファー100μLを加え、2分間インキュベートする。 </li><li> 10分間真空。 </li><li> 8000ではを使用して、コレクションプレートとメジャーDNA濃度を取り外します。一般的に〜の収量は100 ng /μlに、この方法で期待することができる。 </li></ol> 3。細胞播種<ol><li> HEK293細胞をトリプシン処理し、計数されています。 </li><li> 2×10 4個の細胞をThermoFisher 96ウェルマルチドロップを使用して、パーキンエルマーViewplateの各ウェルに分注されています。 </li><li>細胞を37℃で一晩インキュベート℃および5％CO 2で 。 </li></ol> 4。トランスフェクション<ol><li>丸底96ウェルプレートのウェルあたり25μlの無血清培地でのcDNAを100ngと100ngのGFP-Grb2のプラスミドDNAのミックスを調製する。 </li><li>ウェルあたり0.5μlのTransfectinを含む25μlの無血清培地を追加します。 </li><li>ミックスとタイマーfoを開始R 30分。 </li><li>穏やかなディスペンス法を用いて細胞にTransfectinのcDNA /ミックス50μlを移します。代わりに、トランスフェクション混合物をプレートに分注し、その後第一細胞が上に追加することができます（リバーストランスフェクション）。 </li><li> ℃、5％CO 2、37℃で一晩細胞をインキュベートします。 </li></ol> 5。画像収集<ol><li>オペラソフトウェアを起動します。実験のセットアップの画面のスナップショットを図3に示します。 &quot;設定&quot;タブを選択し、20倍、客観的かつ正確なプレートタイプを選択します。 &quot;襟&quot;は異なるプレートタイプでピントを可能にするために客観的に正しい値に設定されていることを確認します。 </li><li> &quot;顕微鏡&quot;タブを選択します。 FITC（488レーザ）やUVなどの露出2（365レーザー）などの露出の定義1。両方のエクスポージャーのUVフィルタをアクティブにして、カメラ1とカメラ2への露出2〜露出1を割り当てます。露出1露出2の40ミリに対して800ミリ秒までの露光時間を設定します。 </li><li> &quot;顕微鏡&quot;タブを選択します。 eを定義FITC（488レーザ）やUVなどの露出2（365レーザー）などxposure 1。両方のエクスポージャーのUVフィルタをアクティブにして、カメラ1とカメラ2への露出2〜露出1を割り当てます。露出1露出2の40ミリに対して800ミリ秒までの露光時間を設定します。 </li><li>暴露1を選択します。高さが0μmにフォーカスを設定します。 &quot;フォーカス&quot;を選択します。一度当て、カメラ1を公開します。露出面を最適化し、 &quot;高さを取る&quot;をクリックして、フォーカスの高さを調整します。 〜3000の最大ピクセル強度を与えるために露光時間とレーザーパワーを変更します。露出パラメータを保存します。露出2についても同じ手順を繰り返します。 </li><li> &quot;実験の定義&quot;タブを選択します。レイアウトとsublayoutを作成します。関連するレイアウト、露出、参照画像、skewcropファイルとsublayoutをドラッグアンドドロップします。実験を保存します。 </li><li> &quot;自動実験&quot;タブを選択し、画像を取得。 </li></ol> 6。画像解析（1.46h ImageJのバージョンに基づいています。） <ol><li>使用して独自のパーキンに変換します。フレックスファイルがタグ付きのイメージ形式に変換します。tifファイルFlex2Volocityアカペラスクリプト。 </li><li><ol><li>スタックで、その結果、イメージシーケンスとしてはImageJで画像をインポートします。 </li><li> Hyperstackメニュー項目にイメージ/ Hyperstack /スタックを選択することにより、2チャンネルhyperstackにスタックに変換します。スライスの数は、インポートされたスタックの半分に設定する必要があります。 </li><li>イメージ/ DUPLICATEコマンドを使用してGFPのチャネルの重複：重複hyperstackのチェックボックスをマークしてチャンネル指定：1-1。来世重複スタックを使用します。 </li></ol></li><li>プロセスを選択/スタックヒストグラムを用いて、0.01％の飽和画素のコントラストを高めるとImage/Type/8-bitと8ビットに変換します。 </li><li>コントラスト閾値（パラメータ1）Q = 30とバーンセンアルゴリズムを使用して、15ピクセル半径ローカル適応分割を定義します。画像/調整/自動ローカルしきい値メニューに黒の背景に白のチェックボックスオブジェクトにチェックを入れます。 </li><li>セグメンテーションの品質管理：元の画像に分割されたオブジェクトの輪郭オーバーレイを生成します。 </li><li>さまざまな機能測定領域は、それぞれの細胞小器官の平均と合計強度：粒子を分析することによって抽出し直す。結果ファイルを保存します。 </li><li> Rの機能の結果ファイルを開き、ヒストグラムを生成します。 </li></ol> 7。代表的な結果通常の条件下ではGrb2のは、全体の細胞全体にローカライズされています。増殖因子受容体の刺激によって、それは細胞膜に転位し、その後、 図4に示すように、エンドソームに取り込まれます。バインディングGrb2のできる細胞表面受容体の発現は、この移行を誘導するのに十分である。典型的なスクリーニング実験では、GFP-Grb2の局在化には変化は観察されない。しかし、タンパク質を発現させたときに、サブ携帯サイトへの新兵のGrb2は、蛍光顕微鏡により容易に視覚化することができる局在の変化があること。エンドソーム様構造へのGFP-Grb2の再局在におけるEGFR結果のインスタンス、発現のために（ 図4）。このように、ゲノムワイドなライブラリを適用するとき、それは小説Grb2結合する細胞表面タンパク質を同定することができることが期待できる。 この方法は、細胞表面タンパク質の検出に限定されない。例えば、Dynamin2は、GFP-Grb2のは、エンドソームのような募集します （ 図5）を表示するの細胞内局在の変化を誘導する。 Dynamin2はGrb2のC末端のSH3ドメインに結合し、この複合体9,10のエンドサイトーシスに関与している。したがって、このアプローチは、一般的なタンパク質の結合複合体の同定を可能にし、SH2ドメインの相互作用パートナーの同定に限定されるものではない。 転座のいくつかの異なるタイプは、原形質膜、エンドソームに、他の細胞質小胞の構造や核への局在化が期待できる。したがって、すべての画像が、目の検査を受けておくことをお勧めします。しかし、cDNAの大規模なセットをスクリーニングする際に自動画像解析アルゴリズムは、より実用的である。このケースでは、アルゴリズムの組み合わせは、このような細胞の形状の変化を識別するために往復核および一般形態学的なアルゴリズムを識別するために、エンドソーム、細胞質/核検出を識別するために、スポットの検出として、望ましい。これらの異なる表現型の検出方法の使用は、他の場所で11に詳細に議論されてきた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" /> 図1実験の全体的なスキーム。実験は細部cDNAライブラリーの増幅と準備、無料のオープンソフトウェアImageJを用いて、cDNAベクターをプラスレポーターコンストラクト、画像取得と画像解析のトランスフェクションで始まる完全な高コンテンツスクリーニングワークフローを。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" /> Fテカンデッキのigure 2章構成。 （1）左側で、5百ミリリットル谷はバッファ1（40ミリリットル）、2（40ミリリットル）、3（50ミリリットル）、AW（60ミリリットル）とA4（100ミリリットル）で満たされる必要があります。トラフA4は、手順の間に一度再充填する必要があります。 （2）真空マニホールドは、この例では14番目に位置しています。 （3）細菌ペレットとディープウェルプレートは25mlの溶出緩衝液で溶出バッファートラフの隣に、30位に位置しています。 （4）8チャネル·ヘッド用使い捨てヒントは左側にチップラックにロードする必要があり、マルチチャンネルヘッドのためのヒントは、位置40に記入する必要があります。この実験で使用されているテカンFreedomEvo液ハンドラが500μlの注射器が装備されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" /> 図オペラLX上の画像取得の3。オートメーション。 A）の[設定]タブ（1）を選択します。実験（2）に必要なレーザーラインをアクティブにします。画像取得（3）カメラを選択します。実験（4）のためのプレート型と対物レンズを選択します。 B）は顕微鏡タブ（1）を選択します。露出1（2,3）用の光源と露光時間を定義します。よく1に焦点を当てると高さ（4）を取る。 C）実験の定義]タブ（1）を選択します。ドラッグや露出、skewcrop、リファレンス、レイアウトやsublayoutファイル（2）をドロップします。実験ファイル（3）をドラッグ·アンド·ドロップします。 D）の自動実験（1）を選択します。実験ファイル（2）をドラッグ·アンド·ドロップします。適切なバーコード（3）を割り当てます。スタートボタン（4）をクリックすることで画像収集を開始します。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" /> <strocDNA発現によってNG&gt;図4、GFP-Grb2の転。 GFP-Grb2は貫通成長因子受容体の過剰発現時に優勢な細胞質に局在からエンドソーム様構造へ移転し、その後エンドソームに内部化する。左側には、COS M6の細胞の顕微鏡画像を一過性のGFP-Grb2の（上部）またはGFP-Grb2のプラスEGFR（下）を用いてトランスフェクトしたことを示しています。エンドソーム様構造へのGFP-Grb2の移転におけるEGFR結果の共発現。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" /> 図5、GFP-Grb2のcDNAを誘起転座の例。 Grb2の体を介したエンドサイトーシスに関与するGTPアーゼDynamin2は、エンドソーム様構造（円内）に、GFP-Grb2は再配置されます。この実験では、GFP-Grb2のはHEK293T細胞にDNM2で同時トランスフェクトされた。 24時間と画像がOPEで取得した後、細胞をHoechst 33342で染色したRA LX。ワングリーン（GFP）のチャンネルの視野とUV（青;ヘキスト33342）が表示されます。

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

発現クローニングは、このようなウイルス受容体および血液細胞抗原12のような斬新な細胞成分を同定するために、過去に使用されている強力なツールです。ここでは、Grb2のに結合する新規な推定シグナル伝達受容体の同定を容易にする方法を説明します。 プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。 <ol><li>自動化されたプラスミドの調製のためには、細菌ペレットを完全に再懸濁を持つことが必要不可欠です。時には、それは厳密な揺れステップまたはピペットでさらに混合を含める必要があります。 </li><li>ソリューション2と3を添加すると、完全な混合が不可欠であると我々は手動で反転封印されたプレートが自動化されたシェーカーを使用するよりも効率的であることを見出した。それはDNAの切断につながるとしてピはこのステップで避けるべきである。 </li><li>すべての真空手順では、1は、液体が完全に排出されていることを確認する必要がありますプレートから。そうでなければ、低収率は予想されています。 </li><li>溶出の際には、溶出液は、プラスミド結合プレートの下部にあるフォームをドロップすることは非常に一般的です。これらのドロップは、溶出プレートに収集する必要があるので、プラスミドの結合プレートを慎重に持ち上げられ、下部に残留滴を慎重に溶出液をプレートに移しておくことをお勧めします。 </li><li>トランスフェクション時には、複合体形成の時間が重要です。我々は、通常20〜30分に準拠しています。短い時間が推奨されていないながら、最高1時間まで長い時間が、歩留まりを低下させることなく問題ありません。 </li><li>顕微鏡は、倍率の選択が重要になります。ここで使用されるオペラLXのシステムでは、20倍で解像度は、高品質の画像を得るために十分である。高解像度の画像が必要な場合は、目的を変更することができますが、セルの統計的に有意な数値を得るためには、フィールドと高い取得時間数の増加が必要とされる。一般的に、我々は目指してウェルごとに結像される少なくとも100個の細胞を得ることができます。 </li></ol> Grb2の転座検定は、EGFRキナーゼ活性化6の小分子阻害剤を識別するために、他のグループによって使用されています。その場合には、EGFRは、具体的にリガンドが細胞膜にGrb2の動員を引き起こすで有効になります。この相互作用の崩壊は、その後、小分子化合物を用いて検討することができます。同様に、それは、siRNAスクリーンは、c-KITまたはエリスロポエチン受容体などのEGFR-Grb2のシグナリングまたは他のGrb2結合成長因子受容体に関与する内因性遺伝子を同定するために用いることができることを想定することができる。従って、この技術のために複数の潜在的用途がある。類似したアプローチは、Shcを、GABまたはIRSなどの他のアダプター分子のためのGFPタグレポーターシステムに適用することができる。 哺乳動物細胞で、この細胞ベースのアッセイを使用する大きな利点の1つは、それが生理的にrelの識別を可能にするということですevant相互作用。アッセイは、タンパク質複合体形成のために読み出していますが、より重要なのは、関連する相互作用が正しいサブ携帯サイトで監視されます。この点では、この技術は、酵母ツーハイブリッドまたはin vitroアッセイのような他のタンパク質-タンパク質相互作用の方法から成果物を克服しています。それは間接的な相互作用はまたGrb2の募集をもたらす可能性があること、しかし注意すべきである。同様に、結合パートナーの転写アップレギュレーションは、cDNA発現によって誘導することができる。これらの可能性を区別するためには、直接的および間接的な結合の効果を区別するために、適切な二次アッセイを行うことが必要である。 結論としては、GFP-アダプター分子転アッセイは、ゲノムワイドなスクリーニングや創薬アプリケーションのための高いポテンシャルをお約束します。

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> cDNAライブラリー</td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB +アンペア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガス透過性のシール</td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96プラスミドキット</td><td>マシュレ-ナーゲル</td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad社</td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td>分子プローブ</td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td>パーキンエルマー</td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td>ハドソン</td><td></td><td>当社までCP7200 </td></tr><tr><td>自由エボ</td><td>テカン</td><td></td><td>真空マニホールド付き</td></tr><tr><td> 384マルチドロップ</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オペラLX </td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

成長因子受容体によるシグ​​ナル伝達は、細胞が増殖と分化を維持するために不可欠であり、厳格な管理を必要とします。シグナル伝達は、膜貫通型受容体と下流シグナル伝達カスケードの活性化に外部リガンドの結合によって開始される。分裂促進シグナル伝達の重要な調節因子はGrb2は、酵素活性を欠いている2 SH3ドメインが隣接内部SH2（Src相同2）ドメインから成るモジュラー蛋白質である。 Grb2のは構成的にそのN末端SH3ドメインを介して、GTPアーゼソン·オブ·Sevenless（SOS）に関連付けられています。 Grb2のSH2ドメインは、このように、SOS-RAS-MAPキナーゼシグナル伝達カスケードに受容体の活性化を結合するリン酸化チロシン残基における成長因子受容体に結合する。また、シグナリングおよび受容体のエンドサイトーシスの正または負の調節因子としてGrb2のための他の役割が記載されている。 Grb2のモジュラー組成物は、受容体とtransducの様にドッキングできることを示唆している1月3日の異なる経路に沿って多数の電子信号。 ここで説明するには、形質膜へのGrb2の募集を監視する簡単な顕微鏡検査アッセイである。それが刺激に応答して、4月6日 、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きGrb2の細胞内局在の変化を測定するアッセイから適合させられます。 cDNA発現により細胞膜に、例えば活性化上皮成長因子受容体（EGFR）リクルート、GFP-Grb2のGrb2のように結合し、続いて細胞内のエンドソーム区画に再配置することを原形質膜受容体。 Grb2のin vivoでのタンパク質複合体で識別するために、この技術はGrb2の細胞内局在の変化に基づいてゲノムワイドな高コンテンツ画面を実行するために使用することができます。 cDNA発現クローンを、トランスフェクションおよび画像取得の調製は、以下に詳細に説明されています。このような酵母2-HYなどのタンパク質相互作用パートナーを識別するために使用される他のゲノム手法と比較して、BRIDは、この手法は単純な顕微鏡ベースアッセイによる相互作用のサブ携帯サイトで哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の可視化を可能にします。したがって、そのような局在化のパターンとして質的特徴は、同様に相互作用の定量的な強さとして、評価することができる。

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

有能な膜貫通型受容体のシグナリング小説を同定するためのハイコンテンツスクリーニング方法が記載されている。この方法は、大規模な自動化に適しているとの予測を可能にする<em生体内で&gt;</em&gt;タンパク質の結合および哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の細胞内局在。

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

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10.5K ビュー.  University College London. 有能な膜貫通型受容体のシグナリング小説を同定するためのハイコンテンツスクリーニング方法が記載されている。この方法は、大規模な自動化に適しているとの予測を可能にするタンパク質の結合および哺乳動物細胞におけるタンパク質複合体の細胞内局在。

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

PDZ-依存性のCFTRの高分子シグナル伝達複合体のin vitroでの解析で

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...