The development of this protocol was supported by grants from the European Research Council (Advanced Grant TOPAS to M.J.L.) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 to D.C. and SFB487 to M.J.L.). T.S. was supported by the Alexander von Humboldt Foundation.

1。サンプルの調製<ol><li>カバーガラス清掃 注：ヒュームフードの下で動作します。 <ol><li>個々のカバースリップを分離し、カバースリップホルダーにガラス製カバースリップ（直径24mm）を配置するためにきれいなピンセットを使用してください。 </li><li>ビーカーにカバースリップでホルダーを置き、カバーグラスがカバーされるまで、クロロホルムを追加します。室温で1時間にわたり浴超音波処理器中で蒸発し、超音波処理を減らすためにアルミホイルでビーカーをカバーしています。ビーカーからカバースリップホルダーを取り、カバーグラスを乾燥させます。 </li><li>代わりにクロロホルムを5M NaOH溶液でステップ1.1.2を繰り返します。 </li><li>新しいビーカーにカバースリップホルダーを取り、蒸留水で3回洗浄する。 100％エタノールを充填したガラス細胞培養プレート中で洗浄し、カバースリップを置く。 </li></ol></li><li>キャリブレーションサンプルの調製<ol><li>適切な溶媒に蛍光染料を溶解させる。 </li><li>までの蛍光色素の1:10連続希釈液を調製1時から1 nMのフィルタに（0.22μm）の水を滅菌した。 </li><li> 100％エタノールに保存掃除カバースリップを取り、フィルター滅菌水で洗う。スポット別々に洗浄カバースリップ上の各蛍光色素希釈液20μl。カバーグラスを滅菌フードの下で乾燥させます。使用するまで、光とホコリからカバースリップを保護します。単一の蛍光分子（ステップ3を参照）の強度を推定するために、これらのサンプルを使用しています。 </li></ol></li><li>トランスフェクション<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した1時01分ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12で培養CHO細胞（DMEM/F12）、100 U / mlペニシリンおよび37℃で100μg/ mlのストレプトマイシン、内5％のCO 2 注：自家蛍光を最小限にするために、実験を通じてフェノールレッドを含まない培地を使用してください。 </li><li> 、100％エタノール溶液から清浄カバースリップを取り、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でそれらを洗浄し、6ウェル細胞培養plの各ウェルに1カバースリップを置く食べた。 </li><li>トリプシン処理は、カウントし、3×10 5細胞/ウェルカバースリップを含有する6ウェル細胞培養プレート中の密度でシードCHO細胞。細胞が約達成するために、24時間インキュベーター（37℃、5％CO 2）で成長しましょう。トランスフェクションのための最適な細胞密度は80％コンフルエント。 </li><li>各ウェルには、（ 例えば 、2 -アドレナリン受容体βSNAP-タグ）所望のプラスミドDNAの2μgのを希釈し、500μlのOptiMEM培地を含む2別々のチューブ内の6μlのリポフェクトアミン2000。室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1チューブにステップ1.3.4からのソリューションを組み合わせて、トランスフェクション混合物を得るために混ぜる。室温で20分間トランスフェクション混合物をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション（1.3.5）の間に、CHO細胞を取得し、予め温めた（37℃）PBSで二回洗浄する。 1ミリリットル/ 10％FBSを添加したフェノールレッドを含まないDMEM/F12培地のよくなく、抗生物質なしで、PBSを交換してください。 </li><li>全体トランスフェクトを追加イオン混合物を穏やかに各ウェルに滴下して、ステップ1.3.5（1 ml）を加え、完全な混合を確実にするためにプレートを前後に揺する。 </li><li> CO 2 5％、37℃で2〜4時間インキュベートし、次のステップに直後に進むNOTE：これらのトランスフェクション条件は、受容体密度を達成するために最適化された&lt;単一のに適している0.45個/μm2で、分子イメージング。異なるセル、構築物または試薬を使用する際に調整が必要になることがあります。 </li></ol></li><li>タンパク質標識<ol><li> 1μMの最終濃度を得るために、10％FBSを補充した1ミリリットルDMEM/F12培地中のフルオロフォア-BGストック溶液1μlを希釈する。インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を取り、あらかじめ温めておいた（37℃）PBSで2回洗浄します。 1μMの蛍光団のBG溶液1mlを含むPBSを交換し、37℃、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、細胞を3を洗浄10％FBSを補充したDMEM/F12培地中、37℃で5分間インキュベートした各時間に回ピンセットで（標識された細胞との）カバースリップを取り、イメージング室に配置します。 </li><li> 300μlの撮像緩衝液で2回洗浄する。新鮮なイメージングバッファー300μlのを追加し、画像化（その2）にすぐに進んでください。 </li></ol></li></ol> 2画像の取得 注：全反射蛍光を使用してください（TIRF）顕微鏡、油浸高開口数の対物レンズ（ 例えば 、100X magnification/1.46開口数）を装備した、適切なレーザ（例えば405nm、488nmの、561 nmおよび645ナノメートルダイオードレーザ）、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ、インキュベーター、単一蛍光分子を可視化する温度制御。 <ol><li> すなわち 、所望の顕微鏡のパラメータを設定します。、レーザーライン、全反射角度が（このパラメータは、溶込みを制御エバネッセント場の深されたTiON）、露出時間、フレームレート、動画10あたりの画像数。温度ドリフトや結露を避けるために、常にオンヒーター/インキュベーターと温度制御を維持する。 </li><li>顕微鏡の100倍の対物レンズにイマージョンオイルの滴を入れてください。顕微鏡の試料ホルダーに標識した細胞を画像化室を配置し、明視野照明を使用して焦点の細胞をもたらす。 </li><li>全反射照明に切り替えます。しかし、同時に、所望の細胞を探索する光退色を最小にできるように、できるだけ低いレーザパワーを保つ。 </li><li>所望のセルを選択し、細かいピントを調整します。シングルフルオロフォアの可視化を可能にするレベルにレーザーパワーを設定します。画像シーケンスを取得し、。TIFFなどの生イメージシーケンスファイルを保存します。 </li></ol> 3。キャリブレーション（ガラス及び単量体/二量体受容体のコントロールにシングルフルオロフォア） <ol><li>各校正SAMPLを組み立てるイメージングチャンバーに1.2で説明したように、電子用意しました。顕微鏡で各サンプルを配置し、単一のステップで漂白十分に分離回折限界スポットを含むサンプルを選択します。 注：これらのスポットは、蛍光色素の単一分子を表す。 </li><li>工程2に記載されTIRF画像シーケンスを取得する重要 ：同じ撮像パラメータは、較正のためのものも含め全ての実験に使用されなければならない。 </li><li> 4.1から4.2に詳述され検出および追跡分析を行う。 4.2.6で説明したように各粒子の強度を抽出します。これらのデータから、平均値（μ）および単一蛍光体の強度の標準偏差（σ）を計算します。 </li><li> オプション：単量体細胞表面受容体（ 例えば CD86）をトランスフェクトした細胞上で同じ分析を行い、N-末端SNAP 10の1つまたは2つのいずれかのコピーで標識して蛍光団-BG誘導体で標識された。 Folloガラス上の単一のフルオロフォアのために上記の手順ワット。 Calebiro、D. らの説明に従って、標識効率を推定する。10 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>画像シーケンスの準備<ol><li>画像をトリミングする画像処理ソフトウェア（ 例えば、ImageJは ） を使用します。 </li><li>独立した個々のフレームを保存します。TIFF画像を新規フォルダに、各画像フレーム番号に示す。 </li><li>細胞の輪郭に沿って関心領域（ROI）を描き、ImageJの内のメジャーツールまたは別のソフトウェアで同様のツールを使用して、細胞表面の面積を測定する。細胞表面面積でムービーの冒頭粒子の総数で割ることによって粒子密度を計算するためにこの値を使用します。 </li></ol></li><li>粒子検出および追跡 注：このようなU-トラック 13として使用する非商用のソフトウェアは、MATLABでの作業自動的に検出し、単一の受容体粒子を追跡するための環境を、。 注：U- トラックアルゴリズムは、複数の仮説の追跡手法に基づいています。このアプローチは、1フレーム内で指定された粒子は、次のフレームで所定の粒子に対応している表示され、消えたり/他の粒子から/で分割併合する個々の確率が割り当てられているコスト行列を、構築することにより、フレーム間の粒子をリンクします。世界的に、コストを最小化する解、 すなわち 、最も確率の高い1は、最終的に選択されています。また、これは一時的に消え、粒子、蛍光体の点滅によって引き起こされる典型的な現象を追跡することができます。 U-トラック （2.1.0）の最新バージョンは、これらの分析の実行を容易にするグラフィック·ユーザ·インタフェースがあります。 <ol><li>映画の選択インターフェイスを開くには、MATLABコマンドプロンプトで、「movieSelectorGUI」。作成するために指示に従ってください以前に保存した別々の画像から始まる新しいムービーデータベース（4.1.2を参照）。 </li><li>粒子検出および追跡するために必要な画素サイズ以下で、秒単位の時間間隔、開口数、カメラのビット深さ及びフルオロフォアの発光波長を提供する。映画のデータベースを保存します。 </li><li>映画の選択インタフェースから、オブジェクトの種類として、「単粒子 」 を選択、分析を実行します。粒子検出および追跡に使用されるパラメータを定義することができる場所に新しいウィンドウが表示されます。デフォルトのパラメータで始まります。 。検出および/ ​​またはトラッキングの品質はオプション （ 例えば 、いくつかの粒子が検出されたか、トラックが断片化されていない）満足のいくものであれば、後は、これらのパラメータを調整します。トラッキング設定の下で、保存するために「 マトリックス形式にエクスポート追跡結果 &quot; をチェック「trackedFeaturedInfoと呼ばれる単一の行列（フィールド内のすべての粒子の座標と振幅」）。これらのパラメータの詳細については、U-トラックのマニュアルを参照してください。 </li><li>検出アルゴリズムを実行します。このアルゴリズムは、自動的に各回折限界スポット局所強度極大の周りの顕微鏡の点広がり関数に等しい標準偏差が2次元ガウス関数をフィッティングすることによって（ すなわち 、単一の受容体/受容体複合体）の背景の上の位置と強度を決定。その後、追跡アルゴリズムを実行します。 。マットファイルで分析結果を格納します。 </li><li>トラックを視覚化し、検出および追跡の品質をチェックするために、U-トラックパッケージに含まれる「movieViewer &quot;ルーチン、または類似したカスタムのものを使用してください。 </li><li>各フレームで追跡粒子の位置と振幅（ すなわち 、強度）を表示します。matファイルを開きます。ステップ4.2.4で生成されたデータはtracksFinal ARのtracksCoordAmpCGフィールドに含まれています線、および/またはtrackedFeaturedInfo中。粒子の総数から4.1.3で測定された細胞表面面積でこの値を除算粒子密度を算出し検出した。 </li><li> オプション：受容体の粒子の動きを分析すること（4.2.6参照）を時間をかけて、粒子の座標を使用します。 Matlabのまたは類似のソフトウェアを使用して、平均二乗変位（MSD）と拡散係数（D）を計算します。各粒子と考えられるすべての時間間隔（Δt）は 、次の数式を使用して、平均二乗変位（MSD）を計算する。 <img align="middle" alt="式（1）" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg" /> Δtはフレーム内の時間間隔であり、Nが分析ステップ数であり、xおよびyは、インデックスが示すフレームにおいて、粒子のx座標とy座標である。線形関係：指定された粒子の運動の種類を評価するために、時間のプロット上でMSDを使用監督の動きを示唆している自由拡散（ すなわち 、ブラウン運動）、正の曲率（ すなわち 、曲線は放物線のように見える）を示し、負の曲率は、限られた運動14の指標である。自由に拡散粒子の場合には、以下の式を用いて得られたMSDデータを当てはめることにより各粒子の拡散係数（D）を計算する。 <img align="middle" alt="式2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg" /></li></ol></li><li>ガウシアンフィッティング法と粒子サイズの計算 NOTE：キャリブレーションサンプル（ガラスおよび/ ​​または蛍光標識された単量体の受容体上の単一のフルオロフォア）の強度分布がわかれば、受容体複合体のサイズを決定するために、画像シーケンスの開始時に、粒子強度の分布に混合ガウスフィットを実行する（ すなわち 、粒子当たりの受容体の数）10。 Matlabのか、Sを使用して、これらの分析を実行imilarソフトウェア。 <ol><li>強度の最初の変更が発生する前の（光退色に起因する減少がほとんどの場合）のフレームに最初のフレームからの粒子の強度を平均化することにより、各粒子の強度を計算します。 </li><li>次の式に従って混合ガウスフィッティングを行います。 <img align="middle" alt="式3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg" /> φ（i）は 、粒子がiの強度を有する周波数であり、nは成分の数であり、αnの成分nの高さに寄与するパラメータであり、μ及びσは、平均値と基準単一のフルオロフォアの強度の標準偏差である（ステップ3で説明したように計算される） 注 ：Tの決定F検定により判断されるように、彼は徐々に成分を添加するまでのn maxが増加することによって、各画像シーケンスのためのコンポーネント（N 最大 ）の最大数は、もはや、統計学的に優れたフィッティングを生じないない。 </li><li> オプション：（。 例えば 、400フレームシーケンスの最後の60フレーム）ムービーの最後のフレームに得られた強度分布に混合ガウスフィットを実行します。これらのパラメータのための洗練された推定値を提供する。このフィッティングの後に得られた値とμとσを交換して、ステップ4.3.2を繰り返します。 </li><li>混合ガウスフィットの各成分の曲線下面積（AUC）を計算する。異なるサイズ分布全体のAUCで、各成分のAUC値を除算すること（すなわち、モノマー、ダイマー、トリマーなど）の受容体粒子の相対的な存在量を計算します。 </li><li>オプション：別の細胞と異なるサイズの粒子の分布は粒子密度10と相関してプロットを生成する（4.2.6で説明したように計算される）に対応する粒子密度から、使用データ。 </li></ol></li><li>ステップフィッティング法と粒子サイズの計算 注：受容体複合体10のサイズを決定するための別の方法として、ステップフィッティング分析を使用してください。 n個の蛍光団を含むこのように粒子徐々に漂白nステップで強度プロファイルを生成することが期待される-この分析のための基礎は、その瞬間の消失、単一のフルオロフォアの結果の光誘起破壊（退色）があることである。 <ol><li> U-トラックまたは同様の検出/追跡ソフトウェア（4.2.6を参照）によって生成される。matファイルから各粒子の強度プロファイルを抽出します。 </li><li>このような提示1工程として、フィッティングアルゴリズムを使用REF IN。 10、各粒子のための漂白ステップの数をカウントする。 </li><li> オプション ：（4.3参照）は、異なる大きさの受容体粒子の相対量を示す分布を生成し、予め混合ガウスフィッティングの結果を説明したように粒子密度とそれらを関連付けるために、結果を使用しています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: applications to membrane dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

記載されたプロトコルは、単一分子レベルでの細胞表面受容体複合体の空間的配置、移動度及びサイズの分析を可能にする。蛍光タンパク質の使用と比較して、より明るく光安定性である小さな有機フルオロフォアで標識化は、単一の受容体粒子の可視化を拡張できるという利点を有する。非常に低い発現レベルが達成されているので（&lt;0.45レセプター個/μm2）は 、受容体および他...

受容体は、細胞表面感覚細胞外環境に位置しており、このような臭気物質、イオン、小神経伝達物質および大きいタンパク質ホルモンのような様々な刺激に応答する。細胞膜の流動性は、受容体及び他の膜タンパク質の移動を可能にする。これは、タンパク質複合体およびそのような機能単位にアセンブルし、細胞内部にシグナルを伝達する受容体によって使用されるような一過性のタンパク質 - タンパク質相互作用の発生の形成に必須である。例えば、細胞表面受容体1の最も大きなファミリーを構成するG-タンパク質共役受容体（GPCR）は、シグナル伝達の微調整調節に関与することが表示され、di-/oligomersを形成することが示唆されている重要な生理的および薬理学的結果2-5があるかもしれません。 単一分子顕微鏡で直接高spatiotempで可視化する大きな可能性を秘めている経口解像度の関連付けを含む生きている細胞の表面上に位置する個々の受容体の動的挙動は、二量体およびより高次の分子複合体6-10を形成する。これは通常、分子の数千から数百万の平均的挙動を報告し、標準的な生化学的および顕微鏡の方法に比べていくつかの利点を提供しています。 十分に明るく、光安定性、フルオロフォアとタンパク質標識は、単一分子顕微鏡検査のために不可欠です。このプロトコルは、共有結合し、細胞表面の受容体に小さな、明るい有機蛍光団を接続するために最近導入され、SNAPタグ11を利用しています。 SNAPは、不可逆的に蛍光団結合ベンジルグアニン（BG-フルオロフォア）誘導体で標識することができるヒトDNA修復酵素のO 6 -アルキルグアニン-DNAアルキルトランスフェラーゼに由来する20 kDのタンパク質タグである。 CLIP、SNAPに由来し、さら​​に設計タグは、代わりに蛍光団-Cで標識することができるonjugatedベンジルシトシン誘導体12。 本稿で報告されたプロトコルは、トランスフェクトし、ラベルの小さい有機蛍光団との11の受容体をSNAP-タグおよび生細胞10の表面上の単一の受容体または受容体複合体を視覚化するために全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を使用する方法について説明します。細胞外SNAP-タグ化細胞表面タンパク質10の&gt; 90％の標識効率の報告されたプロトコールをもたらす。受容体複合体のサイズおよび移動度を分析するために、ならびに一過性受容体 - 受容体相互作用を捕捉するために単一分子データを使用する方法に関するさらなる情報は、提供される。プロトコル全体の概略的なワークフローは、 図1に示されている。一例として、SNAP-タグ化Gタンパク質共役受容体（GPCR）を有するチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞のトランスフェクションは、フルオロフォア-BG誘導体で標識し、続いてよくquantifへの応用として、yおよびモニタ受容体di-/oligomerizationが記載されている。このプロトコルは、他の細胞表面タンパク質と蛍光タグ（ 例えば 、CLIP）、ならびに他のトランスフェクションおよび標識方法にまで拡張することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="882">
	<tbody>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:259px;">Chloroform</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1585</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">NaOH</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td style="width:261px;">CAUTION: strong base and highly corrosive reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:248px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">32205</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Glass coverslip&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Marienfeld-Superior</td>
			<td style="width:115px;">111640</td>
			<td style="width:261px;">24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.2 mm sterile filter</td>
			<td style="width:248px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:115px;">83.1826.001</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CHO cells</td>
			<td style="width:248px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:115px;">ATCC CCL-61</td>
			<td style="width:261px;">Chinese hamster ovary cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well cell culture plare</td>
			<td style="width:248px;">Nunc</td>
			<td style="width:115px;">140675</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:248px;">GIBCO, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11039-021</td>
			<td style="width:261px;">Phenol-red free medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Biochrom</td>
			<td style="width:115px;">S 0115</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Penicillin - streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P06-07 100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:248px;">Pan Biotech GmbH</td>
			<td style="width:115px;">P10-23100</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">11668-019</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:248px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">31985-047</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorophore-conjugated benzylguanine&#160;</td>
			<td style="width:248px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:115px;">S9136S</td>
			<td style="width:261px;">SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMSO</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1584</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:259px;">Imaging buffer:</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; NaCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A1371</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; KCl</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3582</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; CaCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A2303</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; MgCl2</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3618</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">&#160;&#160;&#160; HEPES</td>
			<td style="width:248px;">AppliChem GmbH</td>
			<td style="width:115px;">A3724</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:248px;">Molecular Probes, Life Technologies</td>
			<td style="width:115px;">A-7816</td>
			<td style="width:261px;">Attofluor Cell Chamber, for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF-M</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Model: DMI6000B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TIRF objective</td>
			<td style="width:248px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">11 506 249&#160;</td>
			<td style="width:261px;">HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">EM-CCD camera&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Photometrics Cascade 512B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:248px;">Pecon</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">Tempcontrol 37-2 digital</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:248px;">NIH, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">u-track software</td>
			<td style="width:248px;">Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Matlab software</td>
			<td style="width:248px;">The MathWorks, USA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution spatiotemporal analysis of receptor dynamics by single-molecule fluorescence microscopy

単一分子顕微鏡は、これらの側面（ 例えば 、動力学、異なる状態や集団、一時的な相互作用の共存）は、一般的にアンサンブル測定で隠されている、などに関して、特に、シグナル伝達分子の挙動を解析するための強力なアプローチとして浮上している標準的な生化学的または顕微鏡の方法で得られたもの。従って、このような受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントは、高時空間解像度で生細胞におけるリアルタイムで追跡することができる。このプロトコルは、小さくて明るい有機蛍光団と直接生きた細胞の表面上の単一の受容体を可視化する全反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いた標識に基づく方法について説明します。このアプローチは、いずれかが正確に、受容体を局在化受容体複合体のサイズを測定し、そのような一過性受容体 - 受容体相互作用などの動的イベントをキャプチャすることを可能にする。プロトコルは、PE方法の詳細な説明を提供しています試料調製、画像取得および画像解析を含む単一分子実験を、rform。一例として、2つのG-タンパク質共役受容体を分析するこの方法の適用、 すなわち 、β2 -アドレナリン及びγ-アミノ酪酸タイプB（GABA B）は受容体が報告されている。プロトコルは、他の膜タンパク質および異なる細胞モデル、トランスフェクション法および標識戦略に適合させることができる。

記載されたプロトコルは、異なる膜タンパク質の種々に適用することができる。例として、β2 -アドレナリン作動性およびGABA B受容体を用いて得られた代表的な結果を10で報告されている。単一分子からの蛍光シグナルが弱いので、バックグラウンド蛍光の最小化が成功した結果の最初の重要なステップである。これにより、広範囲にカバースリップを洗浄（ 図...

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High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

high-resolution-spatiotemporal-analysis-receptor-dynamics-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K ビュー.  University of Würzburg, Germany. This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins. 

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

生物工学

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...