この作品は、米国国立衛生研究所1R21HL092370-01（GG）、1R01 HL095764-01（GG）によって賄われていた。R01HL082694（JW）を、米国心臓協会、ファウンダーズ·アフィリエイト（0855943D、GG）、ストーニーウォルド - ハーバート基金、ニューヨーク（SHP）。

1。準備<ol><li>次のように以下の溶液とチューブを（ 表1）を準備します。 <ol><li>ハンクス液、ペニシリン（100単位/ ml）/ストレプトマイシン（100 mg / ml）を持つ無カルシウム、マグネシウムまたはインジケータ。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、1X、ノーカルシウム、マグネシウムをバッファリングしない。 </li><li>エタノール、70％、500ミリリットルを作る。 </li><li> PBSでホルムアルデヒド、7から10パーセントバッファ付き、500ミリリットルを作る。 </li><li>麻酔ソリューション： <ol><li> AVERTIN。 2,2,2 - トリブロモ慎重5gに2 - メチル-2 - ブタノール5mlを加える。一度溶解し、暗所で室温の原液を保つ。ストック溶液0.25ミリリットルを取ると、ガラス底の瓶で1xPBS 10mlで薄め。 37℃アルミ箔、場所でボトルを包む℃で溶解し、次いで、アリコート5mlのポリプロピレンチューブに、冷蔵庫にキープまで。実験日の朝に1つのアリコートを温める。 </li><li>バルビツレート。 2.6パーセントのバルビツール酸ゾルを与えるためにPBSで原液を希釈しution。ポリプロピレン管3-4 mlのアリコートを置きます。 </li></ol></li></ol></li><li> 3作業領域（ 図1）を整理します。 </li><li><ol><li>体重を決定するために、精密スケール（0.01 gの精度で0〜50グラム）、調査研究の識別番号を記録するための形式、日付、体重、右心、左心とセプタムの重みミクロスケールを：エリア：次の項目を並べ替える0.001グラムの精度で心の重みを判別するために、船の重量を量る。麻酔ソリューション（明らかにマークされている）、液体窒素を用いて小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートの血液や組織標本（ 表1）を収集するために、手術器具（ 表2、図2）、楽器（ 表1）をきれいにするソリューションを提供しています。 </li><li>エリアB：解剖顕微鏡、アンプやラップトップコンピュータに接続された圧力制御ユニットに接続されている右心カテーテル：以下の項目を配置します。カテーテルは、内に配置される水を入れたビーカー。手術器具を（ 表2）を配置し、縫合糸の部分が最適な長さに切断し、重量を量るボートに入れ、テープ（オートクレーブテープが最適である）最適な長さと幅にカットして簡単にアクセスするための顕微鏡や実験室のベンチに並んで、綿棒と除毛·ソリューションを提供します。研究の開始時にカテーテルのキャリブレーションを行います。 </li><li>エリアC：は、気管カニューレ、1 mLシリンジ、縫合最適な長さにカットし、量るボートに入れ、液体窒素を持つ小さなデュワー、氷と一緒に断熱容器、チューブ、24ウェルプレートのBAL収集するためのルーペレンズ：以下の項目を配置しますおよび組織標本（ 表1）。手術器具（ 表2）;ソリューションは、BAL実行すると気管カニューレや楽器を（ 表1）きれいにする。 </li></ol></li></ol> 2。右心カテーテル検査<ol><li>優しく量るbにマウスを置くことによって、精度のスケールを使用して、マウスの重量を量る燕麦。ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。重量を記録する。それは静脈の大きさが十分である限り小さいマウス（17グラム以上）カテーテルを挿入することが可能であり、頸静脈の直径は圧力カテーテルを収容しなければならないので、説明されたプロトコルは20グラム以上であるマウスに最適です。 </li><li> 20グラムの25グラムが30グラム、300μlを与えるための250μlを、与えるために、200μlを与えるために、例えば体重（10μL/ g）を、に応じてAVERTIN注射でマウスをAnaesthetize。正確な注入量は、マウス系統に応じて調整する必要があります。ストレスが麻酔薬への応答を変更する可能性があるので、ゆっくりと静かに動物を扱うようにしてください。 </li><li>ダブルプリーツティッシュペーパーの上にマウスを鎮静されたら、場所。紙の上にID番号をメモします。穏やかに手術野をクリアするために首の腹側面に脱毛ローションをこすります。紙の上に戻ってマウスを置き、1〜2分待つ。 </li><li>腹側面から髪を削除する優しく綿棒と髪の成長の方向に対して髪をなでることで首の。 </li><li>慎重につま先の反射の有無をチェックすることにより、麻酔の十分な深さを決定：マウスは、その足の指のピンチには反応しません。 </li><li>迅速かつリラックスした作業を、右心カテーテル検査の残りの部分では、最適に3から6分、10分以上を服用してはいけません。これは、カテーテルが静脈に滑ると水分の層の上に静脈の内側に移動する必要があるため、組織が乾燥しないことが重要である。手順の一貫したタイミングは、グループ間で比較可能であるデータの生成のために重要である。 </li><li>発泡スチロールの板の上にティッシュペーパーでティッシュペーパーや転送に戻っマウスを置きます。オートクレーブテープを使用して所定の場所に足と頭を修正しました。 </li><li>あごから胸骨（胸の骨）への皮膚の切開を加えます。 </li><li>慎重に右頸静脈を露出させるために下顎骨に向かって甲状腺壮大上向きに解剖するND気管。 </li><li>約0.8倍の倍率（総合倍率[レンズXアイピース]で行われ、レンズにすでに焦点面で解剖顕微鏡下でマウスを保持する場所発泡スチロールのボードは、約8倍速です。 </li><li>慎重に手術鉗子で周囲の結合組織を除去することによって右頸静脈を顕微解剖。 </li><li>右頸静脈の上に縫合糸の2つのピースを置きます。小さな細流に静脈の血流を遮断するために顎骨に最も近い糸を結び、静脈の周りに緩い結び目で胸骨/胸の骨に最も近い糸を配置します。一つは、後で静脈に穴を見つけるために、血液の小さなしずくを使用することができ、これが必要になった。 </li><li>呼吸をして、リラックス（首と顎の筋肉を緩める）接眼レンズを通して静脈にあなたの目を維持する。これは、あなたの手や指がスムーズに、リラックスした、安全に移動するようになります。に最も近い側の鉗子で静脈を押さえながら下顎骨は、他の一方が運営するマイクロ剪刀を用いて2つの縫合の間に静脈に穴をあけます。マイクロはさみを置いて、その手に力を入れ、カテーテルのために感じる。優しく親指と人さし指（ 図3）との間でそれを保持し、カテーテルを取り出す。静脈の穴にカテーテルを挿入します。 </li><li>優しく右心（ 図3）にカテーテルを進める。カテーテルを挿入する必要があるどのくらいの近似インデックスを与えるとモニターを観察するカテーテルでマークを観察する。圧力曲線が表示されると、そっとカテーテルの周りに下糸を締​​めます。カテーテルはそれにコイルを与える引張強度を有しているので、マウスの呼吸と心臓の鼓動は、接辞付加的に、テープを使用してカテーテルをモーションを追加するためです。 </li><li>後で分析するために、2分間録音圧力測定（ 図4）。 </li><li>カテーテルを保持している縫合糸を開き、そっとretrieカテーテルをVEの。圧力変換器の背後にある部分を拭き、水をビーカーに戻してください。圧力変換器には手を触れないでください。 </li><li>安楽死のための領域、血液および脾臓組織のコレクションにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。 </li><li>次の動物を使ってプロシージャを起動します。圧力曲線（2.15）を記録するために待機している間にタイミングが許せば、麻酔薬を注入します。 </li></ol> 3。血液および脾臓のサンプルの収集<ol><li> 、ソリューションをバルビツレートマウス当たり400μlを注入し、1〜2分待つ。これは、日常的に出血している間マウスが不注意にAVERTIN麻酔から回復する可能性を避けるために、我々の研究室で行われます。実験の適切な標準化がマウス当たりバルビツール酸塩の溶液と同じ用量を注入し、血液の収穫前に、同じだけの時間が待っていることによって達成されます。インスティテューショナル·動物実験委員会が許可されている場合と限り動物が前に慎重瀉血に麻酔の深さのために監視されているように、この工程を省略することができる。 </li><li>腹部に切開を加えます。尾静脈（下大静脈）を開き、ホールピペットを用いて血液を収集します。 </li><li>脾臓を削除するか、またはエッペンドルフチュー​​ブと液体窒素中でスナップ凍結に脾臓の一部、または単一細胞の後の準備のためのよく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに。 </li><li> BALのコレクション、肺所属リンパ節、肺、心臓組織のためのワークエリアCにティッシュペーパーの上にマウスを移す。手術器具を清掃してください。 </li></ol> 4。肺や心臓のサンプルの収集<ol><li>筋肉や結合組織の気管自由を解剖。気管下に置く鉗子は、を通して縫合糸を引き出します。そっと穴をカットするのに十分なストレッチを生成します。穏やかな伸びを維持することは、わずかに回転運動を用いて気管カニューレを挿入し、縫合カニューレint型場所はO。ハンクス溶液の液滴を追加し、必要に応じて気管カニューレを挿入するために、気管が湿っていることを確認してください。手順では、手の動きが安全かつ円滑に保つために、首と顎の筋肉をリラックスして、呼吸する。 </li><li>慎重に腹部の端から始まる胸の骨を除去することによって胸郭を開いて解剖する。これは、それが非常に難しいリンパ節を見つけることになるため、胸部の内容を邪魔しないでください。 </li><li>優しくハンクス緩衝液1mlを挿入することによって、気管支肺胞洗浄（BAL）を行い、静かに注射器を回し、BAL液を取り出す。氷の上で3回、近くにチューブと場所を繰り返します。手順では、シリンジに接続し気管カニューレの端に目を保つ。肺の膨張と収縮を観察するために胸部に視線。 </li><li>別のピンセットでリンパ節を見つけて、検索、鉗子の1セットで胸郭壁を保持することによって、収穫肺リンパ節。 24ウェルプレートにリンパ節を置きます。これは、kに重要である今検索する場所：首から始めて、マウスの右側から胸郭の入り口を見つけると脊椎（ 図5）の上に見える。 </li><li>ティッシュペーパーで収穫心臓と場所。慎重にセプタム並ん解剖によって右心を分離します。 、重さ、液体窒素中で凍結をスナップするエッペンドルフチュー​​ブに重量と場所を記録するための作業領域に転送する。 </li><li>主気管支を閉じるには、左肺の葉の周りに糸を置きます。エッペンドルフチュー​​ブおよび単一細胞懸濁液の後の単離のためにハンクス液を含む24ウェルプレートの各ウェルに液体窒素、または所定の位置にスナップ凍結に左肺葉無料、場所を解剖。 </li><li>約を挿入します。 0.5ミリリットル、残りの肺葉に気管カニューレを介してホルムアルデヒド緩衝溶液。膨張後、ホルムアルデヒド溶液を含む50 mlチューブに胸部と場所の肺葉を解剖する。代替研究デザインについては、肺が最適で膨らませることができるMALは、メディアをカットする（10月、PBSで1:4に希釈）、凍結切片の後の準備のために希釈されていない10月を含む金型内で凍結した。別の研究デザインは、スナップ凍結肺組織および肺からの単細胞懸濁液を得る必要とするかもしれない。その場合、どんなインフレは必要ありません：残り肺葉を解剖、よく含むハンクスバッファーに24ウェルプレートに胸部と場所からそれらを取得します。 </li><li>ハンクス緩衝液を用いて洗浄することにより、クリーン気管カニューレを取り外し、手術器具を清掃してください。 </li></ol> 5。右心カテーテルから発生する圧力曲線の解析記録された右心室圧データは、各記録のグループのアイデンティティを知らない状態でLabChart 7ソフトウェアを用いて分析する。 20以上の曲線をランダムに選択し、各曲線の最大値と最小値の心室圧力差（ΔP）を測定する。平均ΔPを右vを与えるために計算されますentricular収縮期圧。

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特別な利害関係は宣言されません。

ここで概説した実験フローは肺、心臓およびマウスにおける免疫系の応答の分析のために右心室収縮期圧およびサンプルの収穫の迅速かつ同時測定を可能にします。手順は、心臓生理学測定、顕微解剖と生細胞研究、組織学的分析、または組織のオミクス解析のためのその後の組織の収穫を兼ね備えています。完全な手順については、マウス当たり未満20分かかります。仕事がないためにエ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> 2 - メチル-2 - ブタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2 - トリブロム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td>消毒石鹸（カバレッジスプレーTBプラスステリス） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1629年から1608年</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール、200プルーフ、無水、絶対ACS / USPグレード</td><td> PHARMCO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td>蒸留水で70％に希釈し、 </td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F1635-500ML </td><td> 7から10までパーセントフォーマに希釈PBS原液と水を使用して1xのPBSの濃度でldehyde濃度</td></tr><tr><td>ハンクス液、無カルシウム、マグネシウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 21から022-CV </td><td></td></tr><tr><td> 10月</td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン（10,000 U / ml）を/ストレプトマイシン（10,000 mg / ml）のソリューション</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、無カルシウム、マグネシウムなし、1xと10xの緩衝溶液</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム26パーセント</td><td>フォートダッジ·アニマルヘルス</td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 実験機器 </td></tr><tr><td>プレート12、24、96ウェル</td><td>ファルコン</td><td></td><td></td></TR&gt; <tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から711-9BM </td><td></td></tr><tr><td>チューブは、EDTAコーティングされた</td><td>ザルスタット</td><td> 2013から08 </td><td></td></tr><tr><td>チューブ0.65ミリリットルと1.7ミリリットルマイクロ遠心</td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ12×75mmのポリプロピレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14から956-1D </td><td></td></tr><tr><td>チューブ、様々なサイズ、ポリプロピレン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> インスツルメンツ </td></tr><tr><td>鉗子、デュモン5位ファイン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11254から20 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子、湾曲極細グレーフェ-0.5ミリメートルのヒント</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11152から10 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子、余分FiありNEグレーフェ-0.5ミリメートルヒントストレート</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11150から10 </td><td></td></tr><tr><td>カニューレ18GA、19 GA </td><td> BD </td><td>精度グライド針</td><td> 、最適な長さに切断し平滑化し外粗い外表面を作成するためにrasped </td></tr><tr><td>はさみ、解剖用はさみスリムブレード9センチメートル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14081から09 </td><td></td></tr><tr><td> BAL、編んだ絹縫合用の糸、4から0 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td>右心カテーテル検査、編んだ絹縫合糸、6-0のための縫合</td><td> Teleflexは医療</td><td> 18020から60 </td><td></td></tr><tr><td>注射器、1ミリリットル</td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>アンプ、PowerLabの4月30日</TD&gt; <td> ADInstrument </td><td>モデルML866 </td><td></td></tr><tr><td>カテーテル、圧力F1.4 </td><td>ミラー·インスツルメンツ株式会社</td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子、はさみVannas春〜2mmのブレード</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から00 </td><td></td></tr><tr><td>ハロゲンイルミネーションデスク拡大鏡</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td>ラップトップコンピュータ</td><td> Asusの</td><td>モデル番号A52F i5プロセッサ、15インチ</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td> Amscope </td><td> HL-250- </td><td></td></tr><tr><td>圧力調整装置</td><td>ミラー·インスツルメンツ株式会社</td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア、Labchart-ProのV.7 </td><td> ADではインストゥルメント</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

右心の機能は、このように右心生理学と肺血管生理学をつなぐ、肺から血液を送り出す事である。炎症細胞浸潤は、サイトカインや成長因子の産生を起草によって、リモデリングプロセス1を開始することによって、心臓や肺の機能の一般的な修飾子です。 左心室に比べて、右心室は圧力変化の比較的狭いゾーンで動作する低圧ポンプです。増加した肺動脈圧、肺血管床および肺高血圧2の圧力の増加に関連付けられています。肺高血圧症は、多くの場合、炎症性肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、または自己免疫疾患の3に関連付けられています。肺高血圧症は、生命と平均余命の質のための予後不良を与えるので、多くの研究がそのMIGメカニズムを理解に向けられているhtは、薬学的介入のための目標である4。肺高血圧症のための効果的な管理ツールの開発のための主な課題は、右心、肺、免疫系の分子や細胞の変化の同時理解の複雑さのままです。 ここでは、マウスの右心内の圧力変化を迅速かつ正確に測定するための手続きのワークフローや心臓、肺、免疫組織からのサンプルの同時収穫を提示します。メソッドが最初に肺動脈5-13の圧力の代理指標として、1990年代後半に開発されたクローズ胸マウスにおける頸静脈を介して右心室の直接カテーテル法に基づいています。主催チームのアプローチは非常に急速な右心カテーテル法を容易にします。これにより、自発的に部屋の空気を呼吸するマウスで測定を行うことができます。異なる作業領域で作業の流れの組織時間遅延を低減すると同時に、生理学実験や収穫免疫、心臓と肺の組織を実行する可能性を開きます。 ここで概説手続きワークフローが大きい薬剤スクリーニングアッセイには、小さなターゲットの実験から、実験室の設定や研究デザインの多種多様に適合させることができる。心エコー検査5,14-17、心臓、肺、免疫組織の収穫を含むように拡張することができ、心臓の生理データの同時取得は、前方の科学的知識の基礎を移動するデータを取得するために必要な動物の数を減らすことができます。また、ここに提示され、手続きのワークフローは、免疫、肺や心臓の機能をリンクするネットワークの知識を得るための理想的な基盤を提供します。ここで概説同じ原則は、必要に応じて他のまたは追加の臓器を研究するために適合させることができます。

右心圧カーブを得るための主要転帰は、右心カテーテルの正しい位置にすることによって達成される。右心室のカテーテル内部の正しい配置は圧力プラトー（ 図4）になりますので、圧力時間曲線の形状は非常に重要です。先端のとがった曲線は、代わりに、右心室の壁に呼吸や心臓の拍動によって移動されるカテーテルを示す。動物の生存の段階で潜在的な問題を検出するには...

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マウスの肺および免疫組織サンプルの採取と組み合わせた右心室収縮期圧測定 |免疫学と感染症 |ビデオ

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

同時に右心機能、肺の炎症、免疫応答を調査するために具体的かつ迅速なプロトコルが学習ツールとして記述されています。ビデオおよび図は大型の研究に小さなために使用されるのに適応され組織されたチーム·アプローチでは、生理学や顕微解剖の手法について説明します。

肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

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25.1K ビュー.  New York University School of Medicine, Tuxedo. 同時に右心機能、肺の炎症、免疫応答を調査するために具体的かつ迅速なプロトコルが学習ツールとして記述されています。ビデオおよび図は大型の研究に小さなために使用されるのに適応され組織されたチーム·アプローチでは、生理学や顕微解剖の手法について説明します。

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

免疫・感染学

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

脂肪組織の免疫細胞の単離

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

要約

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この動画の章

細胞星状に7つのステップ

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌

脂肪組織の免疫細胞の単離

ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

体内上部気道免疫メディエーターレベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

細胞毒性の評価と肺癌精密カットスライスで物質の免疫調節効果

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

肺およびマウスにおける免疫組織サンプルの収穫との組み合わせで右室収縮期圧測定

要約

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細胞星状に7つのステップ

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌

脂肪組織の免疫細胞の単離

ウイルスミミックポリ（I：C）で、妊娠中期の段階でのマウスにおける母性免疫活性化の誘導

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

体内上部気道免疫メディエーターレベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

細胞毒性の評価と肺癌精密カットスライスで物質の免疫調節効果