著者は、技術支援のためのロバートHoldcraftに感謝。この研究は、米国農務省CSREES特別グラント（2009-34155-19957）とハッチ資金（NJ08192）の一部で賄われていた。

1。揮発性物質の局所誘導：草食動物の損傷<ol><li>ブルーベリー植物の二つの枝は、スパンポリエステルのスリーブにパックされます。 </li><li>六マイマイガの幼虫（2回-3 回の齢期）はバッグの内側に配置し、揮発性のコレクションの前に2日間、植物を餌に許可されています。コントロール植物はどんな毛虫を受信しません。 </li><li>揮発性排出量は、3日目（図1）に（プロトコル＃7）以下のように収集されます。ポリエステルのスリーブは、エスケープから虫を防ぐために植物に残ります。 </li></ol> 2。揮発性物質の局所誘導：機械的損傷<ol><li>植物への機械的な損傷は、マイマイガで除去葉面積の量を模倣するためにパンチされた穴を与えたれている。 </li><li>植物当たり五葉は1日目および2日目の最後​​にある基本と葉の上部にある2つの7 mmの穴を負傷している。コントロール治療には、機械的な損傷を受けていません。 </li><li3日目に下記のように&gt;揮発性の排出量が収集されます。 </li></ol> 3。揮発性物質の局所誘導：メジャ<ol><li>ブルーベリー植物が0.1％のTween - 20溶液中メジャのどちらか1または1.5 mM溶液を10 mLで扱われます。 </li><li>メジャは、2オンススプレーボトルを使用して適用されます。コントロール植物は0.1％のTween - 20溶液10 mLを噴霧されています。 </li><li>植物は、午前16時00時間で治療、および17 cmの直径と揮発性のコレクションの前に35センチの高さプレキシグラス室内の15時間のために温室に保管されています。 </li><li>下記のように揮発性の排出量が収集されます。 </li></ol> 4。揮発性物質の全身的誘導：内部信号<ol><li>ブルーベリー植物の下の分岐は、スパンポリエステルのスリーブと袋詰めや袋の内側に六（第2回-3 回の齢期）マイマイガの幼虫を置くことによって破損している。 </li><li>破損した枝は、揮発性の収集チャンバーの外に出たまましばらくbranche損傷した枝の上にSが（ 図2）チャンバ内に配置されます。 </li><li>毛虫は、2日間底枝を餌に許可されています。 </li><li> 3日目に始まる、揮発性物質が損傷を受けた植物の破損していない部分から収集されます。 </li><li>揮発性物質を7日間連続収集されます。コントロール植物は同様の方法で扱われていますが、草食動物の被害を受けなかった。 </li></ol> 5。血管の接続<ol><li>この研究は、ブルーベリー、植物内で異なるブランチ間の血管の接続性の程度を決定する。 </li><li>植物から低い枝の端部は、Oriansらに記載されてローダミン- B（Sigma - Aldrich）を染料（0.25％w / v）を、6mLのソリューションが含まれているフローラルウォーターピックをサポートするためにカットされます。11 </li><li>植物を通して染料の動きは7日間毎日監視されています。 </li><li> 7日後、赤い染色の量が視覚的に植物の異なる位置から評価される。 </li></ol> 6。 HIPVsへの暴露：外部のシグナリング<ol><li>工場内のブランチのいずれかの隣接するブランチからHIPVsにさらさまたはHIPVsへの曝露を受けていない。 </li><li> HIPVsに支店を公開するには、一つ下の枝は、ポリエステルのスリーブと六（第2回-3 回の齢期）マイマイガの幼虫が袋（ 図3）の内部に配置されていると袋詰めしています。 </li><li>植物は、上述と同様なプレキシグラスのチャンバー内にケージに入れています。昆虫は、隣接する枝を誘導枝から放出される揮発性物質にさらされているように、2日間、植物を餌に許可されています。 </li><li>露出（3日目）の後、露出した枝は、外側の昆虫外傷のブランチを（ 図2に示すように）残して、揮発性の収集チャンバ内に配置されます。 </li><li> HIPV -露出支店からの揮発性物質は、後述するように収集され、そして下の枝から消費葉面積の量は、サイオン画像ソフト制を用いて測定される再。 </li></ol> 7。 HIPVsへの暴露：プライミング<ol><li>植物がHIPVの曝露後に&quot;プライミング&quot;されているかどうかを判断するために、植物はプロトコル＃5のように扱われます。 </li><li>植物の半分は誘導隣接するブランチからHIPVsにさらされ、残りの半分が損傷を受けていない枝にさらされている間。 </li><li> 3日目、4つの初期の第2齢のマイマイガの幼虫は、各工場に配置され、下記のように揮発性物質（ 図4）収集されます。 </li><li>揮発性のコレクションの後、最初に、マイマイガの幼虫だけでなく、3日目に損傷しているもので損傷葉を切除していると葉面積の消費量を測定している。 </li></ol> 8。揮発性物質のコレクション<ol><li> HIPV排出量は、プッシュプルシステムを使用して温室でサンプリングされます。草食動物の損傷の治療に毛虫を含む鉢植えの植物の地上部分（茎、枝、そして葉が）、、4 L VOLAの内部に配置されていますタイルのコレクションチャンバー。 2ピースのギロチンは、植物のベースをサポートしています。精製された空気は、2 L /分の速度で、各チャンバーの上部に入ります。 </li><li>揮発性物質を1​​ L / minの速度でチャンバから空気を引っ張ってアルテックスーパーQ吸着剤30mgので満たされたトラップで収集されます。 </li><li>揮発性の収集装置は、4つの異なるプラント（図1）から揮発性物質の同時収集を可能にする、4室で構成されています。 </li><li>コレクションは、午前9時から17:00 hに昼間に実施されています</li><li>コレクションの後、工場からのすべての葉が収穫される、C 60℃でオーブン乾燥、及び計量し、チャンバーは、水道水及び70％エタノールでリンスしている。 </li></ol> 9。揮発性物質の分析<ol><li>スーパー- Qトラップから収集された揮発性物質をジクロロメタンで溶出される（150μL）とn -オクタンの400ngのは、内部標準として追加されます。 </li><li>化合物の分離と定量は、ヒューレットパッカード6890シリーズ上で行われます水素炎イオン化検出器（FID）とAgilent HP - 1カラム（10 mxの0.53ミリメートルX 2.65ミクロン）、およびキャリアガス（一定流量= 5ml /分として彼を使用して装備したガスクロマトグラフ（GC）（図5）、 、速度= 39 cm /秒）。 40で開始温度プログラム° Cが14歳で増加し、1分間保持° C / 180分° C（2分）、その後40℃/ minで200℃、および200℃に保た℃で2分間。 </li><li>化合物の暫定的な同定は、スペルコMDN - 5Sカラム（30 mxの0.32ミリメートル× 0.25μm）を持つ、およびキャリアガスとして彼を装備フィニガンマット8230質量分析計（MS）、に結合バリアン3400 GCで行われている。 MSは、電子イオン化（EI）および250 ° C（ソースの温度）でのトータルイオンクロマトグラム（TIC）モードで動作させます。プログラムは35℃（1分）、° C / minで170℃、その後15℃〜280℃/ minで4℃上昇で始まった</li><li>化合物は、暫定的にNISTライブラリとBのものとスペクトルデータの比較によって同定されていますyのGC保持指数、及び市販の化合物のものとそれらの保持時間を比較することにより。 </li></ol> 10。代表的な結果： 二十二揮発性物質は、ブルーベリーの葉（ 図6）から同定された。 図7は、マイマイガで供給することにより、損傷無傷のブルーベリーの葉と葉の代表的なクロマトグラフを示しています。マイマイガの幼虫による機械的損傷や給餌はコントロール（ 図8）と比較してブルーベリーの葉からローカルに揮発性物質の排出量を増加した。毛虫の摂食に比べて、メジャの治療は、マイマイガ（ 図9）により誘発される17化合物のうち11を誘導した。マイマイガなどで損傷を受けた七日、最初の食害（すなわち、内部信号の欠如）（ 図10）後の植物の無傷の葉からの揮発性物質の全身的誘導の証拠は、しかし、ありませんでした。加えて、一週間後に、非常に遅い動き赤色の染料のメンターは、ブルーベリー、植物の枝（ 図11）の間で観察された。単一のブランチ内の葉の間で高い血管の接続があった。しかし、2つの垂直シュート内に整列枝、そしてシュートの反対側にある2つのブランチ間の低接続の間に中間レベルからローレベルへの接続があった。 HIPVs（ 図12）にさらされていないものに対してHIPVsにさらされた枝から放出される揮発性物質の量との間に差はなかった。しかし、HIPVsはブルーベリーの外部防御的な信号として機能します。葉を摂食マイマイガの幼虫は、以前はそれらの供給が非曝露制御の葉（ 図13）上よりも71パーセント少なく葉材料を消費HIPVsにさらされる。さらに、HIPV -露出支店で消費葉面積の量あたりの排出される揮発性物質の量は示す、未露光の枝（ 図14）に比べて4倍高いことがHIPV - EXからの葉<html>枝は草食性（すなわち、それらがプライミングされた）に柔軟に対応したポーズをとった。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。プッシュプルシステムは、ブルーベリーの植物からの揮発性物質を収集するために使用されます。植物は、ガラスチャンバ内に配置され、清浄な空気がその上を渡されます。吸着剤材料を含むフィルターは、植物から放出されるトラップの揮発性物質に各チャンバーの側面に装着された。真空は、フィルターを通ってチャンバの内側から空気を引っ張るために使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。ブルーベリー植物から全身性の応答を調べるために、下のブルーベリーの枝がどちらかマイマイガの幼虫（右室）によって破損されたまたは破損していない左（左室）。 2日間（3日目）後に、損傷や破損していない植物から無傷の上部の枝からの揮発性物質を採取した。 <html> ontent&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。無傷の枝から葉が損傷した枝からHIPVsに応答するかどうかをテストするには、私はブルーベリー、植物のそれぞれの分岐のいずれかを袋詰め。私は、その後の植物の半分の袋の内部にマイマイガの幼虫を置く。私が使用したバッグは、内側から袋の外に揮発性物質の動きを可能にする。植物はHIPVsに無傷の枝を公開するプレキシグラスチャンバ内に置かれた。揮発性物質はその後、露出した枝から採取された。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。無傷の枝から葉がHIPVsへの曝露後に&quot;プライミング&quot;されているかどうかをテストするには、図3で説明したように実験が繰り返されたが、マイマイガの幼虫は、それぞれの揮発性の収集チャンバ内のHIPV -露出と未露光枝に配置されました。 G&quot;ALT =&quot;図5&quot;/&gt; 図5。揮発性のコレクションの後、サンプルはブルーベリー植物から放出される揮発性物質を特定し、定量化するガスクロマトグラフ（GC）に注入されています。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。少なくとも22の化合物は、ブルーベリーの葉から放出されています。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig7.jpg" alt="図7"/> 図7。マイマイガの幼虫によって損傷無傷のブルーベリーの葉と葉からの典型的なクロマトグラフ。揮発性物質は、無傷のブルーベリーの葉からは非常に低い量で放出される。しかし、葉がマイマイガの幼虫によって破損した場合、揮発性物質の放出が劇的に増加した。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig8.jpg" alt="図8"/> 図8。グラフは無傷の葉、mから放出される22揮発性成分のそれぞれの量を示しています。マイマイガの幼虫によって損傷echanicallyで痛んだ葉、葉。毛虫による除去葉面積の量を模倣する人工的な損傷は、ブルーベリーの葉から揮発性の放射を増加したが、応答は、マイマイガの給餌への葉の揮発性の反応とは異なっていた。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig9.jpg" alt="図9"/> 図9。JAの経路は、ブルーベリーの葉の揮発性の放出を調節するかどうかを試験した。植物は、メジャの異なる量で噴霧した。私は外生的に適用されたメジャの増加する濃度は、ブルーベリーの葉から揮発性物質の排出量を増加させることが見つかりました。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig10.jpg" alt="図10"/> 図10。グラフは制御ブルーベリーの枝からとマイマイガ損傷した植物（全身反応）から無傷の枝から放出される揮発性成分の合計量を示しています。揮発性物質のために収集された7日間連続のTAL。私も7日間の植物の下側の枝に初期損傷後の揮発性物質のない全身的誘導は認められなかった。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig11.jpg" alt="図11"/> 図11。私はブルーベリー、植物内の支店間の血管の接続性の程度を決定するためにローダミン- B（赤色色素）を使用。私はその約を発見した。 80％、20％、5％、染料を含む枝から葉の0％、直接染料、染料を含む支店の支店、そしてブルーベリープラント内の別のシュート内にある支店を含むブランチ上の枝は、それぞれ、だった完全に色素で染色。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig12.jpg" alt="図12"/> 図12のグラフはHIPVsと未露光の枝にさらされた枝から放出される揮発性物質の量を示しています。私はHIPVsへの曝露がいななきで揮発性の排出量に影響しなかったことが判明無傷のブルーベリーの枝を退屈。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig13.jpg" alt="図13"/> 図13。グラフはHIPVsと未露光の枝にさらされるブルーベリーの枝にマイマイガの幼虫が摂食量を示しています。 HIPV -露出した枝上の幼虫は、未露光の枝上のものと比較して葉の少ない量を消費。 <img src="/files/ftp_upload/3440/3440fig14.jpg" alt="図14"/> 図14。私は消費面積あたりの放出率を計算した、私はHIPV -露出枝が増加揮発性の応答のためにブルーベリーの枝に葉をプライミングHIPVsへの暴露を示し、未露光の枝に比べて揮発性物質の放出率を増加していたことが分かった。

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	<li>Dicke, M., Van Loon, J. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitrophic+effects+of+herbivore-induced+plant+volatiles+in+an+evolutionary+context.">Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context.</a> Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).</li><li>Mumm, R., Dicke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+natural+plant+products+and+the+attraction+of+bodyguards+involved+in+indirect+plant+defense.">Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense.</a> Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).</li><li>Hopke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore-induced+volatiles:+the+emission+of+acyclic+homoterpenes+from+leaves+of+Phaseolus+lunatus+and+Zea+mays+can+be+triggered+by+a+&#946;-glucosidase+and+jasmonic+acid.">Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a &#946;-glucosidase and jasmonic acid.</a> FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+electrophysiological+responses+of+the+emerald+ash+borer,+Agrilus+planipennis,+to+induced+volatiles+of+Manchurian+ash,+Fraxinus+mandshurica.">Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica.</a> Chemoecology. 16, 75-75 (2006).</li><li>Rodriguez-Saona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbivore+induced+volatiles+in+the+perennial+shrub,+Vaccinium+corymbosum,+and+their+role+in+inter-branch+signaling.">Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling.</a> J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).</li><li>Karban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage-induced+resistance+in+sagebrush:+volatiles+are+key+to+intra-+and+interplant+communication.">Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication.</a> Ecology. 87, 922-922 (2006).</li><li>Frost, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signalling+by+volatiles+overcomes+vascular+constraints+on+systemic+signalling+and+primes+responses+against+herbivores.">Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores.</a> Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).</li><li>Heil, M., Bueno Silva, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-plant+signaling+by+volatiles+leads+to+induction+and+priming+of+an+indirect+plant+defense+in+nature.">Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).</li><li>Turlings, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+herbivore-induced+plant+odors+by+host-seeking+parasitic+wasps.">Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps.</a> Science. 250, 1251-1251 (1990).</li><li>Makovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volatiles+involved+in+the+nonhost+rejection+of+Fraxinus+pennsylvanica+by+Lymantria+dispar+larvae.">Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae.</a> J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).</li></ol>

私は開示することは何もない

プッシュプル揮発回収装置は、植物の揮発成分のヘッドスペースのコレクションのための標準メソッドを表すここで説明する。この装置は、マイマイガの幼虫による食害にブルーベリーの葉の揮発性の応答を決定するために使用し、また私がイントラ植物のシグナル伝達におけるHIPVsの役割のための新たな証拠を提供させた。 結果は、その毛虫の摂食、外因的に適用され...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>揮発コレクションチャンバー</td><td>分析リサーチシステムズ株式会社</td><td> VCC - G6X12DT - 1P </td><td>ゲインズビル、フロリダ州</td></tr><tr><td>空気圧縮機、20ガロン、オイルフリー、2馬力</td><td>西へ</td><td> 3JR71 </td><td>グレインジャー、（株）が販売</td></tr><tr><td>空気供給システム</td><td>分析リサーチシステムズ株式会社</td><td> VCS - ADS - 4AFM4C </td><td>ゲインズビル、フロリダ州</td></tr><tr><td>空気の収集システム</td><td>分析リサーチシステムズ株式会社</td><td> VCS - MVCS - 4CX1P </td><td>ゲインズビル、フロリダ州</td></tr><tr><td>真空ポンプ100 - 150V、¼馬力</td><td>ガストマニュファクチャリング株式会社</td><td> <a href="http://www.grainger.com/Grainger/GAST-Vacuum-Pump-4F740">4F740</a> </td><td>グレインジャー、（株）が販売</td></tr><tr><td>ジャスモン酸メチル</td><td>シグマアルドリッチ&lt;/ TD&gt; <td> J2500 </td><td>セントルイス、ミズーリ</td></tr><tr><td> Tween - 20を</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 93773 </td><td>セントルイス、ミズーリ</td></tr><tr><td>ローダミン- B </td><td>シグマアルドリッチ</td><td></td><td>セントルイス、ミズーリ</td></tr><tr><td>プラスチックのスプレーボトルは、2オンス</td><td> Setco株式会社</td><td></td><td>クランブリー、ニュージャージー州</td></tr><tr><td>スパンポリエステル袖</td><td>ロッキンガムの機会（株） </td><td></td><td>リーズヴィル、ノースカロライナ州</td></tr><tr><td>スーパーQ揮発コレクショントラップ</td><td>分析リサーチシステムズ株式会社</td><td> VCT-1/4X3-SPQ </td><td>ゲインズビル、フロリダ州</td></tr><tr><td>サイオンのイメージソフトウェア</td><td>サイオン社</td><td></td><td>メリーランド州フレデリック</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 270997 </td><td>セントルイス、ミズーリ</td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフHP 6890 </td><td>ヒューレットパッカード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフバリアン3400 </td><td>バリアン</td><tD&gt; </td><td></td></tr><tr><td> n -オクタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 296988 </td><td>セントルイス、ミズーリ</td></tr><tr><td>質量分析計のMAT 8230 </td><td>フィニガン</td><td></td><td>サンノゼ、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> HP - 1 GCカラム</td><td>アジレントテクノロジー</td><td></td><td>パロアルト、 CA </td></tr><tr><td> MDN - 5S GCカラム</td><td>スペルコ社</td><td></td><td>ベルフォンテ、ペンシルバニア州</td></tr></table>

herbivore-induced blueberry volatiles and intra-plant signaling

草食動物によって誘導された植物の揮発性物質（HIPVsは）一般的に草食動物の攻撃の1,2の後に植物から放出される。これらHIPVsは主に防御的な植物ホルモンであるジャスモン酸（JA）とその揮発性誘導体ジャスモン酸メチル（メジャ）3,4,5によって規制されている。過去30年間にわたって研究者がHIPVsが撃退するか誘致草食動物を、草食動物の天敵を誘致し、いくつかのケースで彼らは草食動物の攻撃の前に植物の防御を誘導または素数できることを文書化している。最近の論文6では、私は違うとはいえ、ブルーベリーの植物からの揮発性物質の放出を誘導マイマイガの幼虫、外因性メジャアプリケーション、および機械的損傷によってその餌を報告した。加えて、ブルーベリーの枝はJAと草食動物（すなわち、直接植物の防御）への抵抗のレベルを増加させることによって、同じ植物の隣接枝から放出さHIPVsに応答し、プライミング揮発性排出によって（すなわち、間接的な植物の防御）。見つける同様のイングスはヤマヨモギ7、ポプラ8、アオイマメ9の最近報告されている.. ここで、私は草食動物（マイマイガ）給餌、外因性メジャアプリケーション、および機械的損傷によって誘導されるブルーベリー揮発性物質を収集するためのプッシュプル方式を説明します。揮発収集ユニットは、4 L揮発収集チャンバー、2ピースのギロチン、入ってくる空気を浄化する空気供給システム、および揮発性物質5,6,10を収集するためにスーパーQ吸着剤を充填したトラップに接続された真空システムから構成されています。スーパー- Qトラップで収集された揮発性物質をジクロロメタンで溶出して分離し、ガスクロマトグラフィー（GC）を用いて定量されています。この揮発性の収集方法は、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用さnの私の研究は6した。これらのメソッドはここで説明されています。簡単に言えば、損傷していないブルーベリーの枝があちこちにHIPVsにさらされているmは、同じ工場内での分岐を隣接。上記と同じ技法を使用して、HIPVsへの曝露後の枝から放出される揮発性物質を収集し、分析されています。

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Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

植物の揮発性物質を収集するためのプッシュプルの方法が記載されている。方法は、草食動物の摂食、外因性のジャスモン酸メチル、及び機械的損傷によって誘導される揮発性成分の比較ができます。この手法はまた、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用されます。

草食動物によって誘導されたブルーベリー揮発性物質とイントラ植物のシグナリング

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

herbivore-induced-blueberry-volatiles-and-intra-plant-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K ビュー.  Rutgers University. 植物の揮発性物質を収集するためのプッシュプルの方法が記載されている。方法は、草食動物の摂食、外因性のジャスモン酸メチル、及び機械的損傷によって誘導される揮発性成分の比較ができます。この手法はまた、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用されます。

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

イメージングカルシウムのためのテクニック 2 +人間の精子でシグナリング

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

生物学

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

草食動物によって誘導されたブルーベリー揮発性物質とイントラ植物のシグナリング

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イメージングカルシウムのためのテクニック^{2 +}人間の精子でシグナリング

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

血管のCaの可視化^{2 +}パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化

代謝率の測定に

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます