初期段階の播種接ぎ木は、植物の長距離シグナル伝達を設定するための強力なツールです。この方法が、実践的なトレーニングなしで播種接ぎ木を成功させるのに役立つことを願っています。シリコーンエラストマーを鋳造するための100x100ミリメートルを測定する正方形のペトリ皿を準備することから始めます。
29ゲージのワイヤーをアセトンでワイヤーの外側の紙のコーティングを取り除いた後、ツイストタイで取ります。そして、金属製のチューブラックのような重い平らな物体で硬くて均一な表面にワイヤーを転がして、ワイヤーを完全にまっすぐにします。次に、正方形のペトリ皿に互いに等距離にある4本のまっすぐなワイヤーを置き、ワイヤーが皿の底に平らになるようにします。
混合シリコンエラストマー溶液をペトリ皿のワイヤーの上に注ぎ、カバーを皿の上に置きます。シリコーンを室温で24〜48時間硬化させた後、きれいな鉗子を使用してペトリ皿からシリコーンシートをはがし、清潔で平らな面に移動します。シリコンシートからワイヤーを取り外します。
チャネルが片側で開いていることを確認するには、細かい点の鉗子を使用して、チャネルの開いた側を塞いでいるシリコンの薄層を取り除きます。きれいなはさみを使用して、チャネルに垂直にシリコンシートを3ミリメートルのストリップにカットします。各ストリップをアルミホイル封筒に入れ、オートクレーブテープで密封します。
ストリップを摂氏121度で少なくとも30分間オートクレーブしてから、必要になるまで保管します。種子を殺菌して春化するには、1.5ミリリットルの微量遠心チューブに0.1%Tween 20を含む1ミリリットルの50%漂白剤溶液を取り、その中に最大100個のシロイヌナズナ種子を懸濁させます。種子懸濁液を室温で5〜10分間インキュベートします。
インキュベーション後、無菌条件下で漂白剤溶液を吸引またはピペットで取り出します。1ミリリットルの滅菌蒸留水で種子を洗い流します。種子をすすぐ間、チューブを適切に反転させるようにしてください。
チューブの上部に残っている漂白剤溶液を取り除くには、すすぎを4回繰り返します。種子を入れた状態で約250マイクロリットルの水をチューブに入れておき、種子を摂氏4度の暗所で3日間保管します。次に、シードをプレーティングする前に、準備したMSプレートの表面に滅菌ストリップを置き、ストリップ上のチャネルとのシードの位置合わせをガイドします。
次に、無菌条件下で作業し、20マイクロリットルのピペットチップを使用して、適切な数の準備された種子を吸引し、プレートに移します。種子がメッキされたら、滅菌ストリップを取り除きます。プレートを覆います。
そして、種子の列に平行なプレートの側面の1つをパラフィルムで密封します。パラフィルムの上とプレートの他のすべての端に通気性テープを巻き付けて、インキュベーション中の空気交換を可能にします。パラフィルムで密封された側面を下に向けて、2つのプレートを慎重に垂直に向けます。
15ミリリットルの遠沈管を間に水平に配置し、輪ゴムで上に固定して、下部で分離します。プレートの表面がベンチトップの表面と100から110の角度を形成していることを確認します。プレートをこの向きで摂氏21度の完全な暗闇で72時間保管し、苗の胚軸の長さが約5ミリメートルになるようにします。
その後、セットアップを暗闇から取り外し、接ぎ木する前に同じ温度で2〜4日間、16時間の光と8時間の暗闇のサイクルに保ちます。メッキ後5〜7日の間に苗を接ぎ木します。苗の上に接ぎ木ストリップを置き、それらの胚軸をチャネルに取り付けます。
苗をそっと配置して、根と胚軸の接合部がシリコーンストリップの底に残り、苗を刈る準備をします。解剖スコープの助けを借りて滅菌フードで作業し、接ぎ木のために接ぎ穂を準備します。新鮮なメスの刃を使用して、胚軸を横切ってまっすぐできれいな垂直にカットします。
苗を押し下げて寒天に押し込まないでください。次に、シュートを取り外し、シュートの切断部分をメディア表面との接触を確保して水和させます。あるいは、シュートを滅菌蒸留水で満たされたペトリ皿に移動させることができる。
台木を準備するには、閉じた鉗子の間のスペース内の根を注意深くつかみ、台木の切断部分をストリップの中央に残して、ゆっくりと回して引っ張ります。次に、先端の細い鉗子を使用して目的のシュートをそっと持ち上げ、チャネルの上部に挿入します。視覚的に、接ぎ穂と台木の間の接触を確認して、成功した移植片を得てください。
すべての移植片が作成されたら、パラフィルムと通気性テープでプレートを包み、苗やシリコンストリップを乱すことなく、前に示したのと同じ方法でプレートをセットアップします。プレートを摂氏26度に設定された成長チャンバーに慎重に移動し、16時間の明と8時間の暗のサイクルで行います。7〜10日後、鉗子を使用してシリコンストリップを片側から慎重に剥がし、苗をチャネルから解放することにより、無菌条件下で接ぎ木苗を評価します。
接ぎ穂から生えている不定根を新鮮なメスの刃で切るか、先端の細かい鉗子で押しつぶして取り除きます。もう一度、台木が接ぎ穂にしっかりと付着して移植片を形成しているかどうかを視覚的に評価します。成功した接ぎ木を苗繁殖土壌に移動し、苗が確立されるまで数日間透明なプラスチックで土壌を覆います。
植物が摂氏21度で前述の明暗サイクルの下で成長するのを待ちます。最適な接ぎ木プロトコルを決定するための接ぎ木試験では、種子が密閉されたチャネルを備えたシリコーンストリップ上で直接発芽した場合、全体的な接ぎ木成功率は25%であることが明らかになりました。胚の子葉を保つために種子の向きを変え、発芽中に下向きに急降下させると、接ぎ木効率がわずかに33%に増加しました種子と成長培地との接触を可能にするためにチャネル上のシリコーンを閉じると、苗の85%が正常に発芽しました。
しかし、接ぎ木成功率は31%にとどまり、ストリップ発芽では最適な苗成長を達成できなかったことを示しています。興味深いことに、苗木を接ぎ木プレート上で垂直に栽培してからストリップの開いたチャネルに挿入するという実証されたプロトコルでは、最初の2回の試験で全体的な接ぎ木成功率が48%になりました。接ぎ木部位のわずかなばらつきに起因する可能性のある3回目の試行の成功率の低さと比較的小規模な試行を考慮すると、全体的な接ぎ木成功率は45%であることがわかりましたこれは、苗を水平プレートで栽培し、固体表面で切断し、接ぎ木ストリップに挿入する方法に匹敵します。
ただし、実証されたプロトコルは比較的時間がかかりません。このプロトコルを使用すると、苗接ぎ木に不慣れなラボは、特定のニーズに合わせてデバイスを簡単にカスタマイズしながら、多数の接ぎ木サポートデバイスを迅速に作成できます。
