この洗練された非侵襲的なツールを使用すると、乳がんの治療と疾患管理に大きな可能性を秘めたマウスの腫瘍増殖動態と転移性コロニー形成をリアルタイムで監視できます。ルシフェラーゼと蛍光検出を組み合わせることは、乳がんの進行と疾患管理の前臨床試験を進めるのに役立つ戦略です。これは抗がん剤研究に適用することができます。
このプロトコルは乳がんに限定されず、肺や膵臓などの他のがん腫にも適用できます。MCF-7、MDA-MB-468、およびMDA-MB-231 GFPおよびルシフェラーゼ陽性細胞を16センチメートルプレート中で別々に80%コンフルエントになるまで増殖させることから始めます。トリプシン処理により細胞を回収した後、各ウェルで増加した数の細胞を黒い96ウェルプレートに播種する。
その後、すべてのウェルを100マイクロリットルのDMEMで満たし、摂氏37度、5%CO2インキュベーターで16〜24時間インキュベートします。PBS中のルシフェリン溶液を1ミリリットル当たり1.5ミリグラムの濃度で調製し、その溶液を摂氏マイナス20度で保存する。インキュベーション後、細胞をPBSで1回穏やかに洗浄してから、100マイクロリットルのルシフェリン溶液を各ウェルに加える。
2分間待ってから、生物発光を用いて全ての乳癌細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定した。マウスを注射する前に、500万個のMCF-7およびMDA-MB-468細胞を200マイクロリットルのPBSに、200万個のMDA-MB-231 GFPおよびルシフェラーゼ陽性細胞を100マイクロリットルのPBSに移した。麻酔をかけられたマウスを注射用に準備するには、円錐形を仰臥位で頭の上に置きます。
次に、乳腺の上のマウスの腹部を綿棒を用いてエタノールで拭き取り、第4の乳腺を鉗子で持ち上げてから、脂肪パッドの下に27ゲージの針を挿入し、調製した細胞懸濁液100マイクロリットルをゆっくりと注入する。注射後、マウスをフードから取り出し、意識に戻るまで観察中の新しいケージに移します。生物発光検出の前に、左手で首を持ち、手を左に傾けて意識のあるマウスを拘束し、下半身を仰臥位に置いたマウスの顔を上向きにします。
1ミリリットルのシリンジを用いて、100マイクロリットルの30ミリグラム/ミリリットルのルシフェリンをマウスの左下腹部象限に腹腔内に注入する。麻酔なしでマウスを7分間保持し、続いて腫瘍動態を測定する前に麻酔チャンバー内で3分間保持する。マウスがインキュベーションされている間に、ソフトウェアを開き、[初期化]ボタンをクリックしてイメージングシステムを初期化します。
セットアップを自動露出に保ち、自動で露光時間を60秒にし、f / stop oneの開口部で媒体をビニングし、励起フィルタをブロックし、発光フィルタを開きます。初期化が終了したら、[イメージング ウィザード] と [生物発光] を選択し、[次へ]、[フィルターを開く] の順にクリックして、画像の被写体でマウスを選択します。フィールド ビューで、ステージ C を 10 cm で、被写体の高さを 1.50 cm で選択します。
次に、「イメージ・セットアップ・ステージ」をクリックして C.ドアを閉じて「取得」ボタンをクリックする前に、マウスがステージ上に適切な仰臥位に置かれていることを確認してください。画面に画像が表示されるのを待ちます。もう一方のマウスについてもこの手順を繰り返します。
肺転移を検出するには、原発巣の強い信号を厚紙の厚紙で覆い、肺の腹側だけをカメラに向かって露出させます。前述ののと同じパラメーターを使用してイメージをキャプチャします。乳癌細胞株を蛍光GFPを発現するレンチウイルスベクターに感染させ、FACソーティングに供した。
GFP陽性細胞を感染後2日目に選別し、播種し、蛍光顕微鏡により可視化した。インビトロルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ活性レベルの細胞数依存的な増加で確認した。さらに、ルシフェラーゼ活性と細胞数との間に線形相関が見出された。
乳癌細胞株を注入した後、マウスを2週間ごとに生物発光読み取りに供し、腫瘍増殖動態を決定した。腫瘍増殖動態は、MDA-MB-231細胞株の方が、攻撃性の低い細胞株MCF-7およびMDA-MB-468よりも速かった。発光活性を3つの細胞株について定量した。
注射後6週間で、採取された腫瘍はGFP発現を維持していることが判明した。また、陽性の生物発光測定値は、マウス全体の肺からリアルタイムで得られた。肺を採取して陽性転移コロニーを確認し、転移コロニーをGFPおよび生物発光について観察した。
注射手順を実行する際に注意することがより重要です。不適切な注射は、腫瘍の増殖速度または腫瘍の不在の偏差につながる可能性がある。GFP発現を検出することで、生体内および生体外で肺転移を調べることができます。
また、免疫組織化学に基づく染色による肺の組織病理学の研究も可能です。この技術は、薬物有効性試験の効果などの新しい疑問を探求するのに有用であり得る。
