マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

私たちの研究は、酸化鉄ナノ粒子プラットフォーム上で画像誘導治療薬を使用して乳がん転移を治療することに焦点を当てています。目標は、がん関連死の主な原因である転移組織に特化した効果的な治療法を開発することです。動物を犠牲にすることなく、全身治療薬が目的の組織に到達したかどうかを判断するのは難しい場合があります。

私たちのナノ粒子は、MRIや光学イメージングモダリティを使用して画像化できるため、生きた動物での薬物送達と蓄積を監視できます。転移性乳がんに対する現在の治療法は、転移に特異的ではなく、有効性にばらつきがあり、望ましくない副作用を引き起こします。当社のナノ粒子プラットフォームは、特に転移性ニッチを標的としており、副作用の証拠なしにその送達を非侵襲的にモニタリングすることができます。

これまで、当社のナノ粒子プラットフォームを用いて転移のドライバーであるmiR-10bを標的とし、転移と転移の成長を阻止することができました。臨床応用を見据えて、治療計画を最適化し、有効性を最大化するために、この製剤の薬力学を調査しています。まず、冷凍マトリゲルを摂氏4度に24時間置き、マトリックス抽出物を液化させます。

研究に必要な細胞の総数を決定した後、細胞をトリプシンし、PBSで洗浄します。細胞を200Gで5分間遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルの冷却PBSに再懸濁して、細胞ストックを作成します。

次に、セルの総数を10の40倍に希釈して、1ミリリットルあたり6セルの累乗にします。次に、等量の冷却マトリックス抽出物を添加して、最終濃度が10の1倍で、50マイクロリットルあたり6細胞の累乗になるようにします。注入前に抽出物が固まるのを防ぐために、混合物を氷の上に置いてください。

麻酔をかけたマウスを加熱パッドのノーズコーンに移します。麻酔の手術面を確認した後、角膜乾燥から目を保護するために眼軟膏を塗布します。次に、注入部位の近くの皮膚をアルコールワイプで洗浄し、数秒間乾燥させます。

乳腺番号4に誘導して、原発腫瘍と一般的な転移部位との間のシグナルの重複を最小限に抑えます。次に、セルストックを上下にピペットで動かして、セルを再懸濁します。50マイクロリットルの氷冷細胞懸濁液を29ゲージの針でインスリン注射器に引き込みます。

針斜角を目的の乳腺の乳首の真下にマウスの体と平行に挿入し、細胞を安定してゆっくりと注入します。注射終了後、少なくとも5秒間針を皮膚に残して、マトリゲルが固化し、漏れを防ぎます。その後、マウスをウォーミングパッドの上の清潔なケージに移動して回復し、完全に歩行可能になり、胸骨の横臥を維持できるようになるまで監督します。

腫瘍の成長と転移の発生を監視するために、麻酔をかけた転移性乳がんマウスモデルに、体重1キログラムあたり150ミリグラムのルシフェリンを腹腔内に注射します。マウスを温暖化パッドのケージに戻して、ルシフェリンを目覚めさせて代謝できるようにします。次に、イメージングシステムスキャナーを使用して、ルシフェリンの注入後約10分からマウスを画像化します。

最大5匹のマウスを仰臥位で一緒に画像化し、マウスの全身が視野ガイドマーキング内に含まれ、できるだけまっすぐに向けられるようにします。透明なテープを使用して腕を固定し、腋窩リンパ節をよりよく視覚化します。ここで、イメージングシステムソフトウェアで、生物発光イメージングの[露出]を[自動]、[ビニング]を[中]、[FStop]を[1]、[励起]を[ブロック]、[放出]を[オープン]、[FOV]を[D]、[高さ]を1.50に設定します。

原発腫瘍をイメージングする場合は、通常、その表面的な位置のために強い信号を発します。[Exposure] を [Auto] に設定します。転移を監視する場合は、原発腫瘍を黒い電気テープで慎重に覆い、手動で曝露を300秒に設定して、かすかな信号を捕捉します。まず、ナノドラッグの投与量は体重に基づいているため、転移性乳がんマウスの体重を量ります。

マウスの体重1キログラムあたり10ミリグラムの鉄ナノドラッグを充填した29ゲージの針でインスリン注射器を準備します。次に、麻酔をかけた動物の尾を摂氏30〜35度の温水に30秒間沈めて、尾静脈を拡張します。その後、尻尾から余分な水分を拭き取り、70%アルコールワイプで注入部位を清掃します。

次に、針の斜角を尾の約半分から外側尾静脈に挿入します。プランジャーを少し引き戻して、針への血液のフラッシュバックで配置を確認します。挿入が成功したら、ナノドラッグを約5〜10秒のゆっくりとした速度で着実に注入し、40マイクロリットルの注射を行います。

注入部位近くの尾部の皮膚の下に溶液が溜まっていないこと、および暗いナノ粒子溶液による静脈の黒ずみによって、注入の成功を確認します。注射部位をガーゼで押さえ、針を抜く。出血が止まるまで約30秒間圧力を維持します。

転移サンプルを採取するには、まず生物発光イメージングを用いてマウスをイメージングします。転移を採取した後、採取した組織をシャーレに入れます。イメージングシステムソフトウェアで、生物発光イメージングの[露出]を[自動]、[ビニング]を[中]、[FStop]を[1]、[励起]を[ブロック]に、[放出]を[オープン]に、[FOV]を[D]に、[高さ]を1.50に設定します。

蛍光イメージングの場合は、[露光]を[自動]、[ビニング]を[中]、[FStop]を1、[励起]を675、[蛍光]を720、[ランプレベル]を[高]に、[FOV]を[D]に、[高さ]を1.50に設定します。次に、マウスの死骸をBLIで画像化し、収集する価値のあるがん組織が残っているかどうかを判断します。次に、収集したがん組織をPBSですすいでください。

顕微鏡検査や定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のために組織を採取するには、最適な切断温度の化合物に組織を埋め込み、処理の準備が整うまで摂氏マイナス80度で保存します。誘導結合プラズマ発光分光法のために組織を採取するには、空の1.7ミリリットルのチューブを使用してスケールを風袋化します。ティッシュをチューブに入れ、その重量を記録します。

ティッシュを凍結した後、処理の準備ができるまで摂氏マイナス80度で保管します。最適な切断温度のクライオ切片で、新鮮な凍結サンプルを厚さ10マイクロメートルの顕微鏡スライドに埋め込みます。チャンバと検体ホルダーの温度は、組織の種類に応じて、摂氏マイナス20度から摂氏マイナス15度の間で調整します。

組織切片を4%パラホルムアルデヒド溶液に15分間浸して、スライドに固定します。スライドをPBSで慎重にすすいでください。次に、DAPIを含むメディウムを使用してスライドにカバーを滑り込ませ、組織構造を視覚化します。

蛍光顕微鏡を使用して、ナノ薬物送達を示すCy5.5蛍光の組織切片を調べます。蛍光シグナルがバックグラウンドノイズでないことを、非注射動物のネガティブコントロールサンプルと比較することで確認します。ナノドラッグで治療したマウスは、投与から1週間後に肺転移において有意な生物発光シグナルを示し、肺組織における転移の存在を確認しました。

蛍光イメージングにより、NanodrugからのCy5.5の蓄積は、治療を受けたマウスの転移性肺組織にのみ確認されました。