Desidero ringraziare i molti studenti universitari che hanno lavorato nel mio laboratorio e ha contribuito all&#39;evoluzione di questi protocolli. NAT ha ricevuto il sostegno del Skidmore-Union Network, un progetto stabilito con un ANTICIPO PAGATO NSF sovvenzione.

I. RNA Mount tutto ibridazione in situ in Elasmobranchi Marine 1. Embrione Fissazione e preparazione <ol><li> Skate embrioni può essere messo in scena secondo Ballard 7. Stadi ottimali per il rilevamento di espressione genica dipende dal tessuto di interesse. Per tenere traccia di espressione genica nel tratto digestivo pattino, le fasi 27-30 sono ottimali 7. </li><li> Dissect embrioni in PBS, separando gli embrioni dal sacco vitellino. </li><li> Fissare in 30 ml di appena fatta paraformaldeide 4% (PFA) in una provetta da 50 ml a 4 ° C con gentile dondolio. Fix per 24 ore. </li><li> Lavare embrioni in PBT, due volte per 15 min, rotazione a temperatura ambiente. Tutte le ricette di soluzioni per il montaggio in situ di RNA intero &#39;s sono inclusi (Tabella 1). </li><li> Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di metanolo 25%, 50% e 75% metanolo: PBT dondolo a temperatura ambiente. La durata dei lavaggi dipende dallo stadio degli embrioni. Per la pre-neurulation scena embrioni, 5 min di ogni lavaggio nella serie metanolo è sufficiente. Per gli embrioni più vecchi di fase 30, lavaggi possono durare fino a 30 minuti. Per determinare se gli embrioni sono sufficientemente penetrato e acclimatati per ogni lavaggio, tenere il tubo in posizione verticale in mano. Se gli embrioni si depositano sul fondo del tubo, allora siete pronti per il lavaggio successivo. Se gli embrioni a galla della soluzione, cambiare la soluzione e ripetere questo passo particolare disidratazione. </li><li> Lavare due volte in metanolo 100% per 10 minuti agitando lentamente. </li><li> Una volta disidratati al 100% metanolo, embrioni devono essere conservati a -20 ° C per almeno 24 ore prima di procedere con il protocollo. Gli embrioni sono stati correttamente conservati a -20 ° C ed utilizzato per montature RNA intero fino a 1 anno. </li></ol> 2. Sintesi di RNA Probe <ol><li> Generare un frammento lineare del gene la cui espressione si desidera rilevare. Ciò può essere fatto mediante amplificazione PCR o linearizzare un plasmide con il genedi interesse. Per amplificare mediante PCR, primer scegliere il cui legame siti fiancheggiano il gene inserire e conservare i siti di legame di RNA polimerasi della regione amplificata. Per i plasmidi di uso comune come PBS o pGEM, M15 in avanti e reverse primer sono l&#39;ideale. In alternativa, linearizzare un plasmide mediante digestione 15 microlitri di DNA QIAGEN miniprep con un enzima che scinde alla estremità 5 &#39;del gene. Gel estrarre e purificare con l&#39;apposito kit QIAquick. </li><li> Invertire trascrivere RNA utilizzando la sonda 8 microlitri di plasmide lineare o 100 ng del prodotto di PCR come modello utilizzando la RNA polimerasi appropriata (vedi Tabella 2 per reazione di trascrizione). </li><li> Incubare la reazione di trascrizione inversa per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Per confermare la reazione, eseguire 1 microlitri della reazione di trascrizione su un 1% di agarosio / TAE gel. Esegui gel a 100 mVolts fino a quando il colorante ha appena incontrato il gel. Una singola banda di primo piano dovrebbe essere visibile. Il modello lineare frammento di DNA può essere debolmente visibili a molecolare maggiorelar peso. </li><li> Aggiungere 1 ml di RNasi-free DNasi I per la reazione di trascrizione e incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Per precipitato, aggiungere 100 microlitri TE pH 8, 10 pl 4 M LiCl, 300 ul 100% EtOH e incubare a -20 ° C per almeno 60 minuti o per una notte. </li><li> Spin per 10 min a 4 ° C una microcentrifuga a 14.000 rpm. </li><li> Lavare pellet con% EtOH 70 e aria secca. </li><li> Risospendere RNA sonda in 20 ml di dH 2 O. Aggiungere 80 ml di tampone di ibridazione (tampone di ibridazione deve essere pre-riscaldato a 70 ° C). La sonda può essere memorizzato in tampone di ibridazione 80% per diversi mesi a -20 ° C o più a -80 ° C. </li></ol> 3. Embrioni pre-trattamento e ibridazione <ol><li> Rimuovere embrioni conservati in metanolo 100% da -20 ° C. Per i più piccoli embrioni procedere con il passo (3.2). Per la successiva fase di messa in scena embrioni (29/30 &lt;) si può visualizzare un strato di epidermide che si e &#39;tolto&#39; dal corpo dell&#39;embrione. Sotto il microscopio, con attenzione dissect lo strato epidermico per massimizzare la penetrazione della sonda. </li><li> Embrioni Luogo in fiale di vetro puliti scintillazione. Reidratare gli embrioni della serie metanolo inverso descritto sopra: (75%, 50%, 25% metanolo: PBT) agitando delicatamente ogni soluzione per ogni 5-30 min a temperatura ambiente. Reidratazione completa con due lavaggi di PBT per 10 minuti ciascuno, delicatamente a dondolo. </li><li> Per rimuovere qualsiasi pigmento, embrioni candeggina con perossido di idrogeno al 6% in PBT per 1 ora a temperatura ambiente, dondolo. </li><li> Rimuovere perossido di idrogeno mediante lavaggio tre volte in PBT, (dondolo a temperatura ambiente, 10 min ciascuna). </li><li> Trattare embrioni con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda durante l&#39;ibridazione. La quantità di proteinasi K e la durata del trattamento dipende dal tessuto che si desidera esaminare e l&#39;età dell&#39;embrione. Tessuti più superficiali e più giovani embrioni richiedono K più breve e meno proteinasi, mentre i tessuti più profondi e più embrioni richiedono una maggiore concentrazione e un trattamento più lungo time al permeabilize pienamente l&#39;embrione per l&#39;ibridazione della sonda. Per esempio, per rilevare Shh nella endoderma dell&#39;intestino di fase 29 embrioni skate, 30 ug / ml di proteinasi K / PBT viene incubata per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Rapidamente il risciacquo embrioni in PBT per lavare via proteinasi K. </li><li> Per disattivare proteinasi K, embrioni postfix con 4% PFA, 0,2% glutaraldeide in PBT per 20 minuti, delicatamente a dondolo. </li><li> Lavare due volte per 10 minuti con PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Per la pre-ibridazione, aggiungere 2-3 ml di pre-riscaldato soluzione di ibridazione per gli embrioni, quanto basta per coprirli. Oscillare delicatamente in un bagno d&#39;acqua riscaldata a 70 ° C per 1 ora. </li><li> Per preparare la soluzione di ibridazione, preriscaldare RNA sonda a 70 ° C per 10 minuti e raffreddare in ghiaccio. Diluire 15-20 microlitri di RNA sonda a 2 ml di soluzione di ibridazione fresco preriscaldato, per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1,0 mg / ml. Rimuovere pre-hybe e aggiungere diluito sonda RNA agli embrioni. Gli embrioni devono essere appena coperto da una soluzione, undd soluzione di ibridazione più se necessario. Coperchio a tenuta sicura di fiala di scintillazione. Ibridano agitando delicatamente in un bagno d&#39;acqua riscaldata a 70 ° C per una notte. </li></ol></li></ol> 4. Posta lavaggi di ibridazione e di ibridazione Anticorpo <ol><li> Rimuovere soluzione di ibridazione con sonda da embrioni e posto in una fiala di scintillazione fresco o provetta Eppendorf. La sonda può essere conservato a -20 ° C e riutilizzati in futuro. Per la post-ibridazione lavaggi, gli embrioni in un posto Netwell seduto in una piastra da 6 pozzetti di coltura. </li><li> Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna delle pre-riscaldato Soluzione # 1, dondolo a 70 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 30 minuti in ciascuna pre-riscaldato Solution # 2, dondolo a 70 ° C. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno in TBST dondolo, a temperatura ambiente. </li><li> Pre-blocco con 10% di siero siero ovino in TBST per 1 ora, a temperatura ambiente dondolo. </li><li> Trasferimento embrioni da Netwell in una fiala di vetro fresco di scintillazione. Aggiungi anti-DIGFrammenti Fab (1:5.000) in 1% di siero siero ovino / TBST agli embrioni. Muovere la notte a 4 ° C. </li></ol> 5. Anticorpo ibridazione Messaggio lava <ol><li> Rimuovere l&#39;anticorpo e scartare. Embrioni posto nuovamente dentro Netwell per lavaggi. </li><li> Lavare 3 volte per 5 minuti in ciascuna delle TBST, dondolo a temperatura ambiente </li><li> Lavare almeno 6 volte per 1 ora ciascuno, dondolo a temperatura ambiente. </li><li> Lavare pernottamento in TBST, dondolo a 4 ° C. Mentre i lavaggi post-anticorpo aiuta a diminuire la colorazione di fondo, massimizzando il numero e la durata dei lavaggi è preferibile. Gli embrioni vengono regolarmente lavati in TBST a 4 ° C, durante il fine settimana. </li></ol> 6. Rilevamento di sonda <ol><li> Make up soluzione fresca NTMT e filtro sterilizzare. </li><li> Scartare la soluzione di lavaggio e gli embrioni TBST posto in un flaconcino di vetro pulito scintillazione. Lavare 3 volte in embrioni NTMT fresco per 10 min a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Rimuovere NTMT lavare e aggiungere miscela di reazionedi 1 x NBT / 1 x BCIP in NTMT. Dal momento che questi reagenti sono sensibili luce, coprire fiala di scintillazione in un foglio e roccia a temperatura ambiente. </li><li> Monitorare la reazione colore ogni 15 min fino genica desiderata è chiaramente visibile. Sonde forti può prendere un minimo di 10 minuti per lo sviluppo. Sonde deboli può richiedere 1-2 ore. Non lasciare che la reazione andare troppo a lungo o la colorazione di fondo cominceranno a comparire (l&#39;embrione tutto inizia a girare un colore opaco viola o marrone). </li><li> Lavare 2 volte per 10 min in PBT a temperatura ambiente, a dondolo. </li><li> Embrioni postfix in paraformaldeide al 4%, 0,1% di glutaraldeide per 1 ora a temperatura ambiente. Gli embrioni possono essere a tempo indeterminato in negozio di fissativo a 4 ° C. </li><li> Visualizza embrioni con uno stereomicroscopio dissezione. Per produrre uno sfondo blu chiaro per le immagini, gli embrioni posto in un piatto con pre-temprato di agarosio all&#39;1% / PBS. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati per Mount I. RNA totale ibridazione in situ in elasmobranchi marine Mount RNA tutto in espressione in situ &#39;s raffigurante di Sonic hedgehog (Shh) e HOXA13 in embrioni da skate sono illustrati nella Figura 1. L&#39;espressione di Shh nei vertebrati superiori si trova nel endoderma notocorda e intestino, e questo pattern di espressione è conservato nel pattino (Figura 1a) 8,9. Elasmobranchi marini hanno un metodo unico di osmoregulation che utilizza la ghiandola rettale di sali secernono. HOXA13 espressione è elevata nella ghiandola sviluppo rettale (Figura 1b) 10. HOXA13 ruolo prodotto genico in patterning ghiandola rettale rimane sconosciuta. II. Paraffina Incorporamento e sezionamento del tessuto Elasmobranch 1. Raccolta e Preparazione del tessuto <ol><li> Dissect tessuto desiderato e fissare in formalina al 10% per 24-48 ore, dondolo a temperatura ambiente. 4% paraformaldeide (PFA) può anche essere utilizzato come fissativo(Vedi Discussione). </li><li> Lavare fissativo mediante lavaggio in PBS, 3 volte per 30 minuti ciascuno. A seconda delle dimensioni del tessuto, tempi di lavaggio può essere ridotto a 10 min o aumentata a 1 h. </li><li> Disidratare embrioni mediante lavaggio in una serie di etanolo 25%, 50% e 75% etanolo: rocking PBS a temperatura ambiente. Di nuovo, il tempo per ogni lavaggio dipende dalla dimensione del tessuto. Per 0,5 cm 3 tessuti, incubare ogni lavaggio per 15 min. Aumentare il tempo per i più grandi pezzi. Se la conservazione a lungo termine del tessuto è desiderato, lavare ulteriori due volte in 75% etanolo e conservare a -20 ° C fino ad un anno. In caso contrario, passare alla fase successiva. </li><li> Ulteriori disidratare mediante lavaggio 3 volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuno, a dondolo. </li></ol> 2. Paraffina Incorporamento e sezionamento <ol><li> Chiarire con il lavaggio dei tessuti 2 volte in xilene per 5 minuti in ciascuna delle fiale di vetro con coperchio a scintillazione con tappo a vite. Xilene renderà il tessuto fragile, in modo da non superare un totale di 10 min per erahes. Il tessuto dovrebbe essere trasparente quando lo si tiene fino a una luce. Se il tessuto è ancora molto opachi dopo due lavaggi, fare un ulteriore lavaggio in xilene per 5 min e quindi procedere con protocollo. Maneggiare xilene all&#39;interno di una cappa di aspirazione con i guanti. </li><li> Rimuovere xilene e riempire la fiala di scintillazione in 2/3 con paraffina fusa. Incubare in un forno a 60 ° C per 30 min. Per la messa paraffina nel flaconcino, si noterà la paraffina solidifica lungo i lati della fiala. Porre la fiala in forno e consentire la paraffina di ri-sciogliere per qualche minuto. Prendere il flacone dal forno e dare la soluzione di un swirl resoconto di mescolare e sostituire in forno per la restante incubazione. </li><li> Paraffina Ripetere incubazioni altre due volte per 30 min. </li><li> Incubare in paraffina due volte per un&#39;ora ciascuno. Modifica paraffina per l&#39;ultima volta e incubare durante la notte nel forno a 60 ° C. </li><li> Il giorno seguente, posizionare il tessuto in una camera riscaldata bagno di paraffina e posto sotto vuoto per 2-3 ore. Questo faciliterà l&#39;infiltrazione di paraffina nel tessuto ed eliminare eventuali bolle d&#39;aria. Per alcuni tipi di tessuto sottile, una fase di vuoto potrebbe non essere necessaria, ma è necessario che gli embrioni interi o del tratto digerente e altri organi con compartimenti luminali. </li><li> Dopo sottovuoto facilitato infiltrazione di tessuto, tessuto posto in uno stampo metallico con paraffina fusa, e raffreddare su una piastra di ghiaccio. Lasciare in ghiaccio oppure a 4 ° C per una notte prima di cercare di rimuovere il tessuto dallo stampo. Blocchi di paraffina di tessuto può essere conservata indefinitamente a 4 ° C. </li><li> Collocare un blocco di paraffina su un microtomo e tagliare 8 sezioni micron. Sezioni deve essere collocato in un bagno d&#39;acqua a 48 ° C, montato su vetro * vetrini Superfrost Plus. </li><li> Vetrini secco per una notte in un forno a 37 ° C. </li><li> Sezioni Conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> III. Alcian Blu / Nuclear Fast Red Stain of Tissue Elasmobranch 1. Alcian Blu Colorare per mucine <ol><li> Luogo scorre con sezioni rivolti verso l&#39;alto su un vetrino più caldo. Melt per 45 min. </li><li> Luogo scivola in un portavetrini. Tutte le soluzioni conseguenti sono contenuti in vasche all&#39;interno di una cappa aspirante. Vetrini vengono lavati trasferendoli da una vasca con una soluzione ad un altro. Assicurarsi che i livelli di soluzione delle vasche riguarda le diapositive, i tessuti sui vetrini siano completamente immersi. Sciogliere paraffina mediante lavaggio diapositive 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. </li><li> Lavare i vetrini due volte con etanolo al 100% per 1 min ciascuna. </li><li> Reidratare vetrini in una serie di etanolo (75%, 50%, 25% etanolo) lavaggio in ciascuna soluzione per 1 min. Lavare in dH 2 O per 1 min. </li><li> Colorare in soluzione Alcian blu, pH 2,5 per 15 min. </li><li> Sviluppare macchia mediante lavaggio in acqua corrente per 3 min. Immergere una volta in dH 2 O. </li><li> Di contrasto nucleare in soluzione rapida di contrasto rosso per 10 min. </li><li> Lavare in acqua corrente per 3 minuti e immergere in dH 2 O una volta. </li><li> Disidratatimonoidrato in una serie di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) per 20 tuffi ciascuno, o 1 min ciascuno. Lavare 2 volte in xilene per 5 minuti ciascuno. Montare con il mezzo di montaggio e DPX coprioggetti. Lasciare mezzo di montaggio a secco e indurire per 48 ore nella cappa prima di manipolare diapositive. </li></ol>

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Non ho nulla da rivelare.

I protocolli presentati sono i metodi classici per monitorare l&#39;espressione genica e di individuare i tipi di cellule differenziate, ed è stato adattato per l&#39;uso in elasmobranchi marini. Ulteriori modifiche di questi protocolli possono essere necessarie per adattarsi alle diverse specie di elasmobranchi. Il problema più comune relativa montatura intera RNA in situ &#39;s è il rischio di contaminazione RNasi e quindi la degradazione della sonda RNA e messaggi endogeni. Du...

<table><tbody><tr><td>10 x transcription buffer</td><td>Roche</td><td>11-465-384-001</td><td></td></tr><tr><td>DIG-RNA labeling mix</td><td>Roche</td><td>11-277-073-910</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Roche</td><td>03-335-399-001</td><td></td></tr><tr><td>RNA polymerase - SP6</td><td>Roche</td><td>10-810-274-001</td><td></td></tr><tr><td>DNAseI, RNAse-free </td><td>Roche</td><td>10-776-785-001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast RNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>EMD-Millipore</td><td>220201</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td><td>Research Organics</td><td>2106D</td><td></td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Netwell inserts</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64713-00</td><td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td></tr><tr><td>6-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td><td>Weaton Science Products</td><td>986540</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fisher</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>59895 (AM2542)</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td></td><td>11585029001</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Roche</td><td>11585002001</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide, 30%</td><td>EMD</td><td>HX0635-1</td><td></td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>VWR</td><td>101301-478</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10-109-541-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DIG Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1137-6623</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt;&#039;s&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26323-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26078-05</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin, NBF</td><td>VWR</td><td>95042-908</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td><td>Weaton Science Products</td><td>986540</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steal base molds</td><td>Tissue-Tek</td><td>4161-4165</td><td>Multiple sizes available.</td></tr><tr><td>Cassettes </td><td>Tissue-Tek</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Slide warmer</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-594Q</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Embedder</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, rotary</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost*Plus slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain&lt;/strong&gt;.</td></tr></tbody></table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Elasmobranchi Marine sono valutati modelli animali per studi biomedici e genomica in quanto sono i vertebrati più primitivi di avere l&#39;immunità adattativa e hanno meccanismi unici per osmoregolazione 1-3. Come le più primitive di vita ganasce-vertebrati con appendici appaiate, elasmobranchi sono un modello evolutivamente importante, soprattutto per gli studi in evoluzione e sviluppo. Elasmobranchi marini sono stati utilizzati anche per studiare tossicologia acquatica e fisiologia dello stress in relazione a 4 dei cambiamenti climatici. Pertanto, lo sviluppo e l&#39;adeguamento delle metodologie è necessario per agevolare ed estendere l&#39;uso di questi vertebrati primitivi a più discipline biologiche. Qui presento l&#39;adattamento di successo del monte RNA tutto ibridazione in situ e tecniche istologiche per lo studio dell&#39;espressione genica e cellulare in istologia elasmobranchi. Controllo dell&#39;espressione genica è uno strumento di sviluppo segno distintivo di biologists, ed è ampiamente utilizzato per studiare i processi di sviluppo 5. Mount RNA tutto ibridazione in situ permette la visualizzazione e la localizzazione di trascritti del gene specifici nei tessuti dell&#39;embrione in via di sviluppo. Il pattern di espressione del messaggio di un gene in grado di fornire indicazioni su ciò che i processi di sviluppo e le decisioni sul destino delle cellule un gene può controllare. Confrontando il pattern di espressione di un gene in differenti stadi di sviluppo, intuizione può essere ottenuto in quanto il ruolo di un gene cambia durante lo sviluppo. Mentre mount intero in situ &#39;s fornisce un mezzo per localizzare l&#39;espressione genica di tessuti, tecniche istologiche consentire l&#39;identificazione di tipi di cellule differenziate e tessuti. Macchie istologiche hanno funzioni diverse. Macchie generale sono utilizzati per evidenziare la morfologia cellulare, ad esempio ematossilina ed eosina generale per la colorazione dei nuclei e citoplasma, rispettivamente. Altre colorazioni può evidenziare cella specificatipi. Per esempio, il blu Alcian macchia riportati in questo documento è una macchia ampiamente utilizzato per identificare mucosaccharides cationico. Colorazione del tubo digerente con Alcian blue possibile identificare la distribuzione di cellule caliciformi che producono mucosaccharides. Le variazioni intervenute nel perimetro mucosaccharide su brevi peptidi distinguere le cellule caliciformi per funzione all&#39;interno del tubo digerente 6. Utilizzando mount intero RNA in situ metodi &#39;s istochimiche e contemporaneamente, decisioni destino cellulare può essere collegato al gene-specifico espressione. Anche se RNA in situ &#39;s e istochimica sono ampiamente utilizzati dai ricercatori, il loro adattamento e l&#39;uso in elasmobranchi marini hanno incontrato un successo limitato e varia. Qui presento i protocolli sviluppati per elasmobranchi e utilizzato su base regolare nel mio laboratorio. Sebbene ulteriore modifica delle RNA ibridazione in situ metodo &#39;s può essere necessaria per adattarsi a diverse specie, i protocolli descritti qui provide un punto di forza di partenza per i ricercatori che desiderano adattare l&#39;uso di elasmobranchi marini alle loro domande scientifiche.

Esempi di Alcian colorazione blu in diverse regioni del L. tratto digestivo erinacea sono mostrati nella Figura 2. Mucina acido contenente cellule globlet sono chiaramente visibili dal blu Alcian macchia tutto il tratto digestivo. La distribuzione di mucine acide differisce in diverse regioni del tratto digerente, riflettendo differenze nella funzione. Mucine acide sono scarsamente prodotta nell&#39;intestino spirale e cloaca, mentre una concentrazione di mucine acide vengono rilevati ...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; e istologia, l&#39;espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell&#39;embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l&#39;uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K Views.  Union College. Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA tutto In situ e istologia, l'espressione genica può essere collegato con le decisioni destino delle cellule nell'embrione in via di sviluppo. Questi metodi sono stati adattati per gli Elasmobranchi marine e facilitare l'uso di questi animali come organismi modello per biomedico, tossicologia e studi comparativi.

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Biologia

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilizzando il monte intero In situ Ibridazione a Link Biologia Molecolare e organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Neuroscienze

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. The sipunculid worm Sipunculus nudus is a crucial fishery resource as it has high nutritional and medicinal values. Currently, the research on the molecular biology of Sipunculus nudus is still in its infancy. The purpose of this article is to develop a sensitive method for localizing specific mRNA in Sipunculus nudus coelomic fluid. The protocol includes detailed steps of ISH, including digoxigenin-labeled antisense and sense riboprobe preparation, coelomic fluid collection and section preparation, specific riboprobe hybridization, antibody incubation, coloration and post-coloration treatments. The representative results obtained from a successful experiment using this method are demonstrated. The protocol should be applicable to other Sipuncula species as well.

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

This protocol describes an effective in situ hybridization approach to detect the mRNA expression levels and spatial patterns of target genes in Sipunculus nudus coelomic fluid.

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

RNA

Riepilogo

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