Benim laboratuvarda çalışmış ve bu protokollerin evrimine katkıda bulunduğu birçok lisans öğrencilerine teşekkür etmek istiyorum. NAT Skidmore-Sendika Ağı, hibe ÖDENEN bir NSF ADVANCE ile kurulmuş bir proje destek aldı.

Deniz Elasmobranchs in situ Hibridizasyon I. RNA Tüm Dağı 1. Embriyo Fiksasyon ve Hazırlık <ol><li> Skate embriyolar Ballard 7&#39;ye göre düzenledi olabilir. Gen ifadesinin saptanması için en uygun aşamada ilgili doku bağlıdır. Paten sindirim sisteminde gen ekspresyonu izlemek için, aşamaları 27-30 Temmuz optimaldir. </li><li> Yolk kesesi gelen embriyolar ayıran, PBS içine embriyo teşrih. </li><li> 4&#39;e bir 50 ml konik boru ° C&#39;de hafif sallama ile taze olarak yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA), 30 ml düzeltildi. 24 saat için düzelt. </li><li> Iki kez oda sıcaklığında 15 dakika dönen için, PBT embriyonlar yıkayın. In situ &#39;s RNA bütün montaj için tüm çözüm tarifler (Tablo 1) dahildir. </li><li> Oda sıcaklığında, PBT sallanan: metanol% 25 oranında dizi, en az% 50 ve% 75 metanol içinde yıkama ile embriyolar kurutmak. Yıkama süresi embriyo evresine bağlıdır. Ön-N içineurulation embriyolar aşamalı, metanol seride her yıkamadan 5 dakika yeterlidir. Aşamada 30 daha eski embriyolar için, yıkama 30 dk kadar sürebilir. Embriyolar yeterince nüfuz ve her yıkama için acclimated olup olmadığını belirlemek için, elinizde dik tüp tutun. Embriyoların tüpün dibine çöker varsa, o zaman bir sonraki yıkama için hazır. Embriyoların çözüm üst şamandıra, çözüm değiştirmek ve o belirli dehidratasyon adımı tekrarlayın. </li><li> Nazikçe sallanan 10 dakika boyunca% 100 metanol içinde iki kere yıkayın. </li><li> % 100 metanol kez susuz, embriyolar protokol ile devam etmeden önce en az 24 saat boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. Embriyolar başarıyla -20 ° C&#39;de saklanabilir ve en fazla 1 yıl için RNA bütün bağlar için kullanılmıştır. </li></ol> 2. RNA Prob Sentezi <ol><li> Ifade algılamak istediğiniz genin doğrusal bir parçası oluşturun. Bu PCR amplifikasyonu yoluyla yapılabilir ya da gen içeren bir plazmid doğrusallaştırma edilebilirilgi. PCR ile yükseltmek için, kimin bağlayıcı siteleri kanadını geni amplifiye bölgede RNA polimeraz bağlayıcı siteleri eklemek ve korumak primerler seçin. Böyle PBS veya pGEM, M15 ileri ve geri primerleri gibi yaygın olarak kullanılan plazmidler için idealdir. Alternatif olarak, genin 5 &#39;ucunda parçalayarak bir enzim ile QIAGEN miniprep DNA 15 ul sindirilmesi ile linearize bir plazmid. Jel ayıklamak ve uygun QIAquick kiti kullanılarak arındırmak. </li><li> Uygun RNA polimeraz (transkripsiyon reaksiyonu için bakınız Tablo 2) ile, bir şablon olarak doğrusal PCR ürününün plazmid ya da 100 ng 8 ul kullanılarak RNA probu uyarlamak Ters. </li><li> 37 °, 2 saat boyunca ters transkripsiyon reaksiyon ° C. inkübe </li><li> Reaksiyon doğrulamak için, bir% 1 agaroz / TAE jeli üzerinde transkripsiyon reaksiyon 1 ul çalıştırın. Boya sadece jel çalıştırmak kadar 100 mVolts jel çalıştırın. Tek bir belirgin bant görünür olmalıdır. Lineer DNA şablonu fragmanı yüksek Moleküler azından belli belirsiz görünür olabilirlar ağırlığı. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C &#39;de transkripsiyon reaksiyonu ve inkübe RNAse serbest DNAz I 1 ul ekle. </li><li> Çökelti etmek için, en az 60 dk ya da gece boyunca -20 ° C&#39;de 100 ul TE pH 8, 10 ul 4 M LiCI, 300 ul% 100 EtOH ve inkübe edin. </li><li> 14.000 rpm, 4 ° C de 10 dakika mikrofüj için Spin. </li><li> % 70 EtOH ve kuru hava ile pelet yıkayın. </li><li> DH 2 O 20 ul yeniden süspanse RNA probu Hibridizasyon tamponu 80 ul (hibridizasyon tamponu 70 ° C ile ön ısıtmaya tabi olmalıdır) ekleyin. Prob -80 -20 ° C veya daha az birkaç ay için% 80 hibridizasyon tamponu saklanabilir ° C </li></ol> 3. Embriyo Tedavi öncesi ve Hibritleşme <ol><li> -20 ° C ila% 100 metanol içinde saklanan embriyolar kaldırma Genç embriyolar için adım (3.2) ile devam edin. Daha sonra sahneye embriyolar (evre 29/30 &lt;) Eğer embriyonun vücudu kapalı &#39;kaldırdı&#39; olan bir epidermis tabakası görebilirsiniz. İçin Mikroskop altında, dikkatle dissprob penetrasyonu maksimize etmek epidermal tabakasını ect. </li><li> Temiz cam sintilasyon şişeleri Yeri embriyolar. Yukarıda tarif ters metanol seride embriyolar rehidrate: (% 75,% 50,% 25 metanol: PBT), oda sıcaklığında 5-30 dakika için hafifçe her biri her bir çözelti ile sallanan. 10 dakika her PBT iki yıkamadan, hafifçe sallanan ile komple rehidrasyon. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBT% 6 oranında hidrojen peroksit, sallama ile herhangi bir pigment, ağartıcı embriyolar kaldırmak için. </li><li> , PBT içinde üç kere yıkama ile hidrojen peroksit çıkarın (oda sıcaklığında, 10 dakika sallama her biri). </li><li> Hibridizasyon sırasında sondanın penetrasyonu sağlamak için proteinaz K ile embriyolar davranın. Proteinaz K miktarı ve tedavi süresine incelemek istediğiniz doku ve embriyonun yaşına bağlıdır. Derin dokulara ve yaşlı embriyolar daha yüksek bir konsantrasyon ve uzun tedavi tim gerektiren süre daha yüzeyel doku ve genç embriyolar, daha kısa ve daha az proteinaz K gerektirire tam prob hibridizasyon için embriyo geçirgenliği. Örneğin, 29, aşama paten embriyoların bağırsak endodermal içinde Shh tespit etmek için, 30 ug / proteinaz K / PBT mL, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Hızla proteinaz K. uzak yıkamak için PBT embriyoların durulama </li><li> % 4 PFA, 20 dakika boyunca PBT% 0.2 glutaraldehit, hafifçe sallanan proteinaz K, postfix embriyolar devre dışı bırakmak için. </li><li> PBT ile 10 dakika boyunca iki kez yıkanır. </li><li><ol class="lalpha"><li> Ön hibridizasyon için, embriyolar onları karşılamak için yeterli önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi 2-3 ml ekleyin. 1 saat boyunca 70 ° C &#39;de ısıtılmış bir su banyosu içinde yavaşça sallayın. </li><li> ° C 10 dk ve buz üzerinde serin için 70 hibridizasyon çözüm, ön ısıtma RNA probu hazırlamak. 0.5-1.0 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için, taze, önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisi, 2 ml RNA probu 15-20 ul seyreltin. Önceden hybe çıkarın ve embriyolar için seyreltilmiş RNA probu ekleyin. Embriyolar adil bir çözüm ile kaplanmış olmalıdır, birdd daha hibridizasyon çözüm gerekiyorsa. Sintilasyon flakon Sıkıca güvenli kapak. 70 ° C&#39;da gece boyunca bir sıcak su banyosu içinde yavaşça sallanarak ile melezleşir. </li></ol></li></ol> 4. Hibritleşme Yıkama ve Antikor Hibridizasyon Ver <ol><li> Taze bir sintilasyon flakon veya Eppendorf tüp içinde embriyo ve yerden probu ile hibridizasyon çözüm çıkarın. Prob -20 ° C&#39;de saklanan ve ileride yeniden kullanılabilir. Post-hibridizasyon yıkar, bir Netwell yer embriyolar 6-iyi doku kültürü plaka oturmuş. </li><li> 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her # 1, 70 ° C &#39;de sallanan için 3 kere yıkayın </li><li> 30 dakika önceden ısıtılmış Çözelti içinde her bir # 2, 70 ° C &#39;de sallanan için 3 kere yıkayın </li><li> Oda sıcaklığında sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan TBST içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş koyun serum ile yapılan ön blok. </li><li> Netwell bir bardak taze sintilasyon flakon embriyolar transfer. Anti-DIG ekle% 1 ısı inaktive koyun serum / embriyoların TBST Fab Fragments (1:5,000). 4 ° C&#39;de gece boyunca sallayın </li></ol> 5. Mesaj Antikor Hibridizasyon yıkar <ol><li> Antikor çıkartın ve atın. Yıkama için geri Netwell içine yerleştirin embriyolar. </li><li> Oda sıcaklığında, sallanan TBST içinde 5 dakika her biri için 3 kere yıkayın </li><li> Oda sıcaklığında sallanan, 1 saat her biri için en az 6 kez yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de, sallanan TBST gecede yıkayın Sonrası antikor yıkar plan boyama azaltmak yardımcı olarak, yıkama sayısını ve süresini maksimize tercih edilir. Embriyolar rutin bir hafta sonu boyunca, 4 ° C de TBST yıkanır. </li></ol> 6. Prob Algılama <ol><li> Taze NTMT çözüm Makyaj ve sterilize filtre. </li><li> Temiz bir bardak sintilasyon flakon TBST yıkama solüsyonu ve yerde embriyolar atın. Oda sıcaklığında, sallanan 10 dakika her biri için taze NTMT embriyoların 3 kere yıkayın. </li><li> NTMT reaksiyon karışımı yıkayın ve Kaldır eklentisi1 x NBT / NTMT 1 x BCIP arasında. Bu reaktifler ışığa duyarlı olduğundan, oda sıcaklığında folyo ve kaya sintilasyon şişenin kapağı. </li><li> İstenilen gen ekspresyonu açıkça görünür oluncaya kadar renk reaksiyonu her 15 dk izleyin. Güçlü probları geliştirmeye kadar az 10 dakika sürebilir. Zayıf probları 1-2 saat sürebilir. Reaksiyon çok uzun veya arka plan boyama (bütün embriyo donuk mor ya da kahverengi rengini açmak için başlar) görünmeye başlayacaktır için gitmesine izin vermeyin. </li><li> Oda sıcaklığında, sallanan at PBT her birinde 10 dk için 2 kez yıkayın. </li><li> % 4 paraformaldehit içinde Postfix embriyolar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 glutaraldehid. Embriyolar 4 ° C&#39;de fiksatif süresiz mağaza olabilir </li><li> Diseksiyon steriomikroskop embriyolar görselleştirin. Ön sertleştirilmiş% 1 agaroz / PBS ile bir tabak resimleri, yer embriyolar için açık mavi arka plan üretmek için. </li></ol> 7. Deniz elasmobranchs in situ hibridizasyon I. RNA Tüm Mount Temsilcisi Sonuçlar Sonic hedgehog (Shh) ve paten embriyolar Hoxa13 in situ &#39;in ekspresyonu gösteren bütün RNA bağlama Şekil 1&#39; de gösterilmiştir. Yüksek omurgalılarda Şşş İfade Notokordun ve gut endoderm bulunur ve bu ifade deseninin paten (Şekil 1a) 8,9 korunur. Deniz elasmobranchs salgılar tuzları rektal bezi kullanan osmoregülasyon benzersiz bir yöntem var. Hoxa13 ifade (Şekil 1b) 10 gelişmekte olan rektal bezinde yüksek. Rektal bezi bilinmemektedir desenleme Hoxa13 gen ürünü rolü. II. Parafin Gömme ve Elasmobranch Doku Kesit 1. Hasat ve Doku hazırlanması <ol><li> İstenilen doku inceleyin ve oda sıcaklığında sallanan, 24-48 saat süreyle% 10 formalin içinde düzeltmek. % 4 paraformaldehit (PFA), aynı zamanda, bir tespit maddesi olarak kullanılabilirler(Tartışma bakın). </li><li> 30 dakika her biri için, 3 kere PBS ile yıkanarak fiksatif yıkayın. Doku ve boyutuna bağlı olarak, yıkama kere 10 dakika için azaltılabilir ya da 1 saat için artmıştır. </li><li> Oda sıcaklığında PBS sallanan:% 25,% 50 ve% 75 etanol, etanol dizi yıkama ile embriyolar kurutmak. Yine, her bir yıkama için zaman doku boyutuna bağlı olacaktır. 0.5 cm doku 3 için, 15 dakika için her bir yıkama inkübe edilir. Büyük parçalar için süreyi artırın. Doku ve uzun süreli depolama arzu edilirse, bir yıla kadar -20 ° C&#39;de% 75 etanol ve depo içinde ek bir iki kere yıkayın. Aksi takdirde bir sonraki adıma geçin. </li><li> Ayrıca sallanan, her biri için 15 dakika% 100 etanol içinde 3 kere yıkama ile kurutmak. </li></ol> 2. Gömülmesi ve Kesit Parafin <ol><li> Vidalı kapaklı kapaklı cam sintilasyon şişeleri 5 dk her ksilen 2 kez yıkanarak doku netleştirin. Ksilen doku kırılgan hale getirecek, tabii ki için 10 dakikalık bir toplam aşmayanhes. Eğer bir ışık o kadar tuttuğunuzda doku saydam bakmak gerekir. Doku iki yıkamadan sonra hala çok opak ise, protokol ile devam sonra 5 dakika için ksilen içinde ek bir yıkama yapmak ve. Sadece eldiven ile bir davlumbaz içine ksilen anlaştım. </li><li> Ksilen çıkarın ve erimiş parafin ile 2/3 dolu sintilasyon flakon doldurun. 30 dakika için bir 60 ° C fırın içinde inkübe edin. Şişenin içine parafin koyarak zaman, parafin flakon kenarları boyunca katılaşmaya göreceksiniz. Fırında şişeye yerleştirin ve parafin, bir kaç dakika için yeniden çözmek için izin verir. Fırından çıkardığınız flakon çıkarın ve çözüm inkübasyon kalanı için fırında karıştırmak ve değiştirmek için hızlı girdap verir. </li><li> Tekrar parafin 30 dakika boyunca iki kez daha inkübasyonlar. </li><li> Bir saat her iki parafine inkübe edin. Parafin son bir kez değiştirin ve 60 ° C fırında gece inkübe. </li><li> Ertesi gün, 2-3 saat için vakum altında ısıtılmış bir parafin haznesi ve yerinde doku yerleştirmek. Bu doku içine parafin geçişlerini kolaylaştırmak ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak olacaktır. Ince doku bazı tipleri için bir vakum adım gerekli değildir, ancak bu insan embriyosu ya da sindirim sistemi ve lümen bölmeli diğer organlar için gerekli olabilir. </li><li> Erimiş parafin ve bir buz plaka üzerinde serin bir metal kalıp içinde doku, yer doku infiltrasyonu vakum kolaylaştırdı sonra. Kalıptan doku çıkarmak için çalışmadan önce buz üzerinde ya da 4 ° C&#39;da gece boyunca bekletin. Dokusunun parafin blokları 4 ° C&#39;de süresiz olarak saklanabilir </li><li> Sıra parafin bir mikrotom üzerine blok ve 8 mikron bölümleri kesmek. Bölümler ° C 48 ısıtılmış bir su banyosu üzerinde süzülüyor ve cam Superfrost * Plus slaytlar monte edilmelidir. </li><li> Bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca kurumaya kayar. </li><li> Ihtiyaç ° C ye kadar 4 Mağaza bölümleri. </li></ol> III. Alsiyan Mavi / Nükleer Hızlı Kırmızı Elasmobranch Doku Leke 1. Alsiyan Mavi Mukinler için Leke <ol><li> Sıra sıcak bir slayt üzerinde yukarı bakacak bölümleri ile slaytlar. 45 dakika eritin. </li><li> Sıra bir slayt tutucunun içine kayar. Tüm sonucu çözümleri davlumbaz içine küvetler bulunur. Slaytlar başka bir solüsyon ile bir küvet arasında transfer ile yıkanır. Küvetler çözüm düzeyleri slaytları kapsar emin olun; slaytlarda dokuların tamamen su altında. 5 dakika her ksilen slaytları 2 kez yıkanarak parafin eritilir. </li><li> 1 dakika her biri için% 100 etanol ile slaytlar iki kez yıkayın. </li><li> 1 dakika için her çözüm yıkama bir etanol dizi slaytları (% 75,% 50,% 25 etanol) rehidrate. 1 dakika dH 2 O yıkayın. </li><li> 15 dakika Alsiyan Mavi Çözüm, pH 2.5 Leke. </li><li> 3 dakika süreyle akan su ile yıkama ile leke geliştirin. DH 2 O zamanlar batırın </li><li> 10 dakika için Nükleer Fast Red Counterstain çözelti içinde Counterstain. </li><li> 3 dakika süreyle akan su içinde yıkayın ve dH 2 O bir kez daldırma. </li><li> Dehidrnateeğimler 20 her biri, ya da 1 dakika her biri için bir dizi etanol (% 25,% 50,% 75,% 100,% 100) halinde aminoasit, karbonhidrat. 5 dakika her ksilen 2 kez yıkayın. DPX montaj orta ve lamelleri ile monte edin. Slaytlar manipüle önce davlumbaz 48 saat süreyle kuru ve sertleşmeye orta montaj izin ver. </li></ol>

<ol>
	<li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs.">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li><li>Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).</li><li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+water+stress:+evolution+of+osmolyte+systems.">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li><li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models.">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li><li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections.">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li><li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract:+a+review.">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li><li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract.">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch,+Leucoraja+erinacea.">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li><li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium:+a+review.">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li><li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+degradation+in+the+human+colon:+production+of+sialidase,+sialate+O-acetylesterase,+N-acetylneuraminate+lyase,+arylesterase,+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria.">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li><li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett's+esophagus:+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort.">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li><li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status.">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li><li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut.">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li></ol>

Ben ifşa etmek başka bir şey var.

Sunulan protokoller gen ekspresyonu izlenmesi ve farklılaşmış hücre türleri tespit için klasik yöntemlerdir ve deniz elasmobranchs kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokollerin ayrıntılı değişiklikler farklı elasmobranch türlerin uyum için gerekli olabilir. In situ &#39;s RNA bütün montaj ile ilgili en yaygın endişe RNaz kontaminasyon riski ve böylece RNA probu ve endojen mesajları kayıplardır. İki yönleriyle dikkate alınması gerekir: Spastine Özg...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Adaptif bağışıklık var ve osmoregülasyon 1-3 için benzersiz mekanizmalara sahip en ilkel omurgalılar olarak Deniz elasmobranchs biyomedikal ve genomik çalışmalar için hayvan modellerinin değerlenir. Eşleştirilmiş ekleri ile en ilkel canlı çeneli-omurgalılar olarak elasmobranchs özellikle evrim ve gelişme çalışmaları için, evrimsel önemli bir model vardır. Deniz elasmobranchs ayrıca iklim değişikliğinin 4 ilişki sucul toksikoloji ve stres fizyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Böylece, metodolojilerin geliştirilmesi ve adaptasyonu kolaylaştırmak ve çoklu biyolojik disiplinlerin bu ilkel omurgalıların kullanımını yaygınlaştırmak için gereklidir. İşte situ hibridizasyon ve gen ekspresyonu ve elasmobranchs hücre histolojisi çalışma histolojik teknikler RNA bütün mount başarılı uyum sunuyoruz. Gen ekspresyonu İzleme gelişimsel başina bir işaretidir araçtırogists ve yaygın olarak gelişim süreçleri 5 incelemek için kullanılır. In situ hibridizasyon RNA bütün montaj gelişen embriyonun dokularda görselleştirme ve belirli bir gen transkript lokalizasyonu için izin verir. Bir genin mesajının ifade desen gelişimsel süreçler ve hücre kaderini belirleyen bir gen kontrol edebilir ne içgörü sağlayabilir. Farklı gelişim aşamalarında bir genin ekspresyonu desen karşılaştırarak, içgörü gelişimi sırasında gen değişikliklerinin nasıl rolüne elde edilebilir. In situ &#39;s tüm montaj dokuya gen ekspresyonu yerelleştirmek için bir araç sunarken, histolojik teknikler farklılaşmış hücre tipleri ve dokuların tespiti için izin verir. Histolojik lekeleri çeşitli işlevlere sahiptir. Genel lekeleri hücre morfolojisi vurgulamak için kullanılır, örneğin sırasıyla hematoksilen ve çekirdek ve sitoplazma genel boyama için eozin,. Vardır Diğer lekeleri spesifik hücre vurgulayabilirsiniztürleri. Örneğin, alcian mavi mucosaccharides belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir katyonik leke bu yazıda leke. Alcian mavisi ile sindirim sistemi Boyanması mucosaccharides üreten goblet hücrelerinin dağılımının tespit edebilirsiniz. Kısa peptidler üzerine mucosaccharide bileşenlerinin değişimleri sindirim sistemi 6 içinde işlevi tarafından goblet hücreleri ayırt. Eşzamanlı in situ &#39;s ve histokimyasal yöntemlerle RNA bütün montaj kullanarak, hücre kaderini belirleyen gen-spesifik ekspresyonu ile bağlantılı olabilir. RNA in situ &#39;s ve histokimyası yaygın olarak araştırmacılar tarafından kullanılıyor olmasına rağmen, deniz elasmobranchs onların uyum ve kullanımı sınırlı ve çeşitli başarı tanıştım. İşte elasmobranchs için geliştirilen ve benim laboratuvarda düzenli olarak kullanılan protokoller mevcut. In situ &#39;in hibridizasyon metodu ile de RNA daha fazla değişiklik farklı türler uyum için gerekli olsa da, burada p açıklanan protokolonların bilimsel araştırmalar için deniz elasmobranchs kullanımı uyarlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir başlangıç ​​noktası rovide.

L. farklı bölgelerinde alcian blue boyama örnekleri erinacea sindirim sistemi Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Globlet hücreleri içeren Asit musin sindirim sistemi boyunca leke alcian blue tarafından net bir şekilde görülebiliyor. Asit müsin dağılımı dolayısıyla fonksiyon farklılıkları yansıtan, sindirim sisteminin farklı bölgelerinde farklıdır. Asit müsin yüksek konsantrasyon distal barsakta (2b Şekil 2a ve 2c karşılaşt...

Watch this Scientific Journal Video about RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs at JoVE.com

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon ve histoloji, gen ekspresyonu gelişen embriyonun hücre kaderi kararlar ile bağlantılı olabilir. Bu yöntemler deniz elasmobranchs uyarlanmış ve biyomedikal, toksikoloji ve karşılaştırmalı çalışmalar için model organizmalar olarak bu hayvanların kullanımını kolaylaştırmak edilmiştir.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

rna-situ-hybridization-whole-mount-embryos-cell-histology-adapted-for

Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K Görüntüleme.  Union College. RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek In situ Hibridizasyon ve histoloji, gen ekspresyonu gelişen embriyonun hücre kaderi kararlar ile bağlantılı olabilir. Bu yöntemler deniz elasmobranchs uyarlanmış ve biyomedikal, toksikoloji ve karşılaştırmalı çalışmalar için model organizmalar olarak bu hayvanların kullanımını kolaylaştırmak edilmiştir.

Video: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...