この作品は、クローン病と潰瘍性大腸炎カナダの財団（CCFC）と健康研究（CIHR）のためのカナダの研究所からBAV、営業の補助金によって支えられている。 GBはCIHR卒業学生の身分によって賄われていた。 BAVは、小児消化器病の小児IBDの研究カナダリサーチチェアの腸管と肝疾患（子）財団議長児です。

1。 シトロrodentium接種およびマウスの経口胃管栄養の準備<ol><li>準備し、オートクレーブルリアベルターニ培地（LB）。 </li><li>実行可能なCを得る滅菌白金耳またはピペットチップを用いてLB寒天プレート上に凍結グリセロールストックとストリークからrodentium。 37℃で一晩インキュベートする。接種ループまたはピペットチップを用いてLBプレートからコロニーを持つファルコン培養管の滅菌LB培地3 mlを接種する。接種物の調製は、無菌技術を使用して行われるべきである。 </li><li> Cをインキュベートrodentium文化好気的に37℃、200rpmでベンチインキュベーションシェーカーで一晩。接種LBブロスは、一晩培養した後に濁って見えるはずです。 </li><li>一晩 、100μlの各マウスを強制経口投与した1mlシリンジに取り付け胃管栄養針をひっくり返した電球を使用して、 rodentium文化 。しっかりと首と背中の上にたるんだ皮膚をつかんで優しく首筋マウスを、親指と指を使って。頭部を固定し、強制給餌針の挿入のための食道をまっすぐに人差し指で動物の頭を後ろに引きます。 </li><li>直立姿勢でマウスを維持し、その口の側面に沿って、その舌の上に強制飼養針のバルブ先端を向ける。そっと口の屋根に沿って針を渡し、食道の下のそれを進める。この手順の中で感じた何らかの抵抗がある場合は、強制飼養針を取り外し、それを再挿入してください。 </li><li>ゆっくり細菌接種の100μlを注入し、静かに強制飼養針を外します。そのケージに戻した後、マウスの呼吸と動作を監視します。 </li></ol>注意： <ul><li>ステップ2および3で、またスープ自体のない細菌汚染がないことを確実にするために一晩培養する無菌LBブロス3mlで無菌技術を用いて鷹の培養管を準備します。 LBブロスで一晩培養した後に明らかに表示されます。 </li><li&gt;は静かに細菌の等しい用量は、ステップ4で、各マウスに配信されるように強制経口投与のための注射器をロードする前にファルコンチューブ内の文化を攪拌。 </li><li>それが24時間以上にわたって接種されている場合は一晩培養した培養液は捨てられるべきです。 </li><li>すべてのC. rodentiumの感染や感染動物の筐体は、バイオセーフティレベル2の施設で実施されなければならない。 </li></ul> 2。 Cの結腸上皮関門透過性を測定するrodentium感染マウス<ol><li>所望の時点、感染後に障壁の完全性を測定します。 </li><li>アッセイ当日、4 kDaのフルオレセインイソチオシアネート（FITC）デキストランは150μlの各マウスを強制経口投与し、標準曲線を準備するために80ミリグラムミリリットル-1の濃度になるように生理食塩水（PBS）に溶解し、リン酸緩衝十分な準備をします。 </li><li> FITC-デキストラン150μlの首筋マウスと強制経口投与。この時点でケージから餌を撤回します。 </li><li> 4時間後にマウスを麻酔gavagingと心臓穿刺を介して、できるだけ多くの血液（約450μl）のように収集しています。血液凝固を阻止するためにマイクロチューブに3パーセント酸 - クエン酸デキストロースの最終濃度に血液を追加します。マウスを安楽死させると細菌数（ステップ3.1から3.5）をPBS中結腸組織を収集し、組織固定のためにホルマリン、最終的には免疫蛍光染色10％（ステップ4.1から4.8）であった。 </li><li> 4℃で遠心機で12分間、1,000×gで血液サンプルをスピン血清を採取し、PBS中の1/10、1/100に希釈します。複製し、96ウェルプレートに、これらの2つの希釈で各試料100μlを加える。 </li><li> 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、0μg/ mlの：標準曲線を準備するには、以下の濃度になるようにPBSでマウスを強制経口投与するために使用した元の80ミリグラムml -1の FITC-デキストランを薄める。三重で96ウェルプレートに各濃度の100μlを添加する。 </li><li> wavファイルで励起蛍光光度計を用いて、各サンプルの蛍光を定量485nmおよび535nmの発光波長のelength。 </li><li>標準曲線をプロットすることにより、生データを分析します。入力各サンプル中のFITC-デキストランの濃度を決定するために標準曲線によって生成された直線の方程式に各サンプルの生データ。 </li></ol>注意： <ul><li>手順4以降では、氷の上に血液サンプルを保持し、光への曝露を最小限に抑えます。 </li><li>重篤な組織損傷がこのポイントの後に発生するようにした時点で、または前に上皮バリアの完全性を測定する場合は、7日後の感染症は、最適です。深刻な被害が出現する前に、障壁の完全性を測定することは、あなたが Cの間に透磁率の最大の違いを判別することができマウス系統間でrodentium感染 。 </li><li>感染していないコントロールマウスも上皮バリアの完全性のためにテストされていることを確認します。 </li></ul> 3。 Cの組織における細菌負荷の測定rodentium感染マウス<ol><li> 1ミリリットル滅菌PBS追加ndはラウンドビーズオートクレーブした金属は無菌操作を用いて、2 mlの遠心チューブを底を打った。各動物から採取した個々の組織は、別々のPBSのチューブ内に配置されます。組織の添加前にチューブの重量を量る。 </li><li>マウスの盲腸および結腸を削除します。結腸から盲腸を分離し、鉗子を用いて管腔内容物を押し出す。 PBSのチューブにコンテンツを追加します。 10％ホルマリン固定のために遠位結腸と盲腸から0.5cmのセクションを分離した後、縦方向に残存結腸と盲腸を開き、チューブに組織を配置する前に、滅菌PBSで洗浄カット。 </li><li>組織をPBSチューブを計量した後、30 Hzで6分間ビーズビーターを使用してサンプルをホモジナイズする。 </li><li>無菌技術を用いて、96ウェルプレートにウェル当たり180μlの滅菌PBSを追加します。各行の最初のウェルに各均質化したサンプル20μlを添加する。よく混和して、連続的に希釈し、10 -1（最初の我々から希釈液を得るために、各ウェル以前から20μlを添加10 -6〜LL）。グリッド付きの正方形の底のLBプレートに三連で各試料からの各希釈液10μlをプレート。 37℃で一晩インキュベート℃、 </li><li>次に平均コロニー形成単位（CFU）、3カウントを数えて、各サンプルがカウントされたときの希釈を記録します。オリジナル1mlの試料20μlを使用したのと、50で平均CFUを掛けて、サンプルはCFU / mlで、結果としてカウントされたときの希釈率。最後に、CFU / gを決定するために組織重量で割る。 </li></ol> 4。組織学的評価と感染結腸組織の免疫蛍光染色<ol><li>ステップ3.2のように組織を採取します。ホルマリンで一晩ストア組織は、その後、70％エタノールで洗浄してください。パラフィンの組織を埋め込むと染色に5μmの切片を切った。組織学的評価のためにヘマトキシリン​​·エオシン染色および免疫蛍光染色のため、次のステップに進みます。 </li><li>場所のスライドで、前染色組織を脱パラフィンする65 10分間℃の水浴中でコプリン染色壺を置く。次に、2分間ずつ4回の洗浄のためにキシレンのプレーススライド。 95％エタノール、75％エタノールとdH 2 0：スライドは、次のそれぞれに1 5分間洗浄に続いて100％エタノールで2つの5分間の洗浄、再水和されるべきである。これらの洗浄は有害な蒸気への暴露を避けるために、ドラフト内で行う必要があります。 </li><li>あらかじめ温めておいたクエン酸ナトリウム緩衝液、その後30分間蒸し器に場所とコプリンジャーに入れ、スライドは、その後30分間放置します。このプロセスは、潜在的な抗原部位を取り出すホルマリン固定により形成されたタンパク質のクロスリンクが解除されます。 </li><li> 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。 PAPのペンで組織の周りに乾いたスライドやマーク領域は、組織に局在染色試薬を維持し、疎水性の障壁を作成することができます。 </li><li>免疫染色水分チャンバ内のブロッキングバッファーを用いて室温で1時間（ 例えば 、α-ヤギ血清）のブロック組織。 </li><li>堅苦しい薄める抗体希釈バッファーを使用して所望の濃度に進抗体。ブロッキングバッファーを捨て、組織に一次抗体を50から100μlを添加する。 2時間4℃で一晩または室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間、3回PBSアジドで洗ってください。暗闇の中で1時間室温でインキュベートする組織や抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の50〜100μlを添加する。 5分間、3回のdH 2 Oで洗浄します。 </li><li> DAPIはゴールドマウント培地を延長し、カバースリップを適用追加、スライドを脱水。蛍光顕微鏡下でスライドを表示します。 </li></ol>注意： <ul><li> PBSアジドは、ステップ4以降の洗浄培地で細菌の増殖を回避するための代替として新たに調製し、PBSで置換することができる。 </li></ul>

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P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

シトロrodentium感染は、感染症およびマウスにおける大腸炎の両方を研究するための貴重なモデルを提供します。このユニークなモデルは、両方のホストの応答だけでなく、細菌の病原性の性質の特徴付けを可能にします。手順では、このプロトコルの詳細は、このモデルの成功した使用を概説した。 大腸炎を誘発し、応答を解析するときに留意すべきは、このプ?...

腸内細菌の病原体による感染症は、下痢や腸上皮バリア機能障害を含むだけでなく腸の病理と病態生理として、消化管（GI）炎症をトリガします。細菌の病原体は、そのホストの消化管と同様に、このような感染症から身を守る特定の宿主応答を植民地になることによって病原性のメカニズムがよく理解されていない、腸内細菌感染症のモデリングでしかし最近の進歩は、これらのプロセスの理解を助けるために始めている。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。 IBDsクローン病（CD）とUCは慢性腸の炎症や組織の損傷によって特徴付けられる原因不明の複雑な疾患である。腸炎の多くのマウスモデルは、IL10などの遺伝的に改変された菌株での自発的な炎症から、存在している - / - マウスでは、化学の課題に対するデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）やdのような化合物とinitrobenzeneスルホン酸（DNBS）1。これは、IBD患者に存在する不適応な慢性炎症性応答は感染性大腸炎のモデルの研究はまた、潜在的に病原性のホストを定義するための大きな可能性を提供していますので、腸内細菌に腸管粘膜免疫系の異常被ばくによって遺伝的に感受性の個体で2を開発するという仮説が立てられている。腸内細菌への応答シトロrodentium誘発性大腸炎は、腸内細菌とIBDの病因の潜在的メカニズムのさらなる理解への宿主応答の解析を可能にする、よく1,3特徴付けられている感染性大腸炎の希少なモデルの一つであり、不可欠なステップ小説予防及び治療処置を開発インチ C. rodentiumは密接に重要なヒトに関連している（/ E）はグラム陰性取り付けると控えめ、ネズミ特有の細菌性病原体である病原体の病原性大腸菌大腸菌 （EPEC）及び腸管出血性大腸菌大腸菌 （EHEC）3-8。 / Eの病原体の家族が親密に宿主細胞上の非侵襲的な台座のような構造を形成し、盲腸と結腸上皮の根尖宿主細胞膜に付着。 Cと経口チャレンジ10 8 -10 9生物のrodentiumは陰窩、単核球の免疫細胞浸潤および杯細胞枯渇3,4の大腸過形成または伸長によって特徴付けられる感染性大腸炎の堅牢なモデルを生成します。植民地化の初期のサイトでは、数時間チャレンジ後、盲腸のパッチで2〜3日後に感染3遠位結腸に進行が続いています。免疫応答性マウス系統では、病原体のクリアランスは3〜4週間感染1,3,4後に達成される。しかし、多くの遺伝的に改変された菌株、 すなわち遺伝子欠損またはノックアウト（ - / - ）マウスは、increaを表示することが見出されている誇張された損傷および/ ​​または慢性の感染症や炎症9-14の結果感染に対する感受性をセッド。これらのノックアウト株ではこの感染性大腸炎モデルの使用は、生得的なシグナル伝達タンパク質を欠いている多くは、腸の感染症や炎症の解決に不可欠ないくつかの宿主タンパク質を明らかに不可欠となっています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> L培地</td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> 1リットルの水にLBの粉末25グラムを追加します。使用前にオートクレーブ。 </td></tr><tr><td>グリッド付きの正方形の底板</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757-11A </td><td></td></tr><tr><td>ファルコン培養管</td><td>ザルスタット</td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td>電球は胃管栄養針をひっくり返した</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 18060から20 </td><td></td></tr><tr><td> 1mlシリンジ</td><td> BD Biosciences社</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDaのFITC-デキストラン</td><td>シグマ</td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td> C7129 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>フィッシャー</td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸デキストロース</td><td></td><td></td><td> 20mMのctiric酸、110mMのクエン酸ナトリウム、5 mMのブドウ糖</td></tr><tr><td>黒色96ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td>メタルビーズ（5mm）を</td><td>キアゲン</td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10％ホルマリン</td><td>フィッシャー</td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> 5mlのバイアル</td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>フィッシャー</td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>フィッシャー</td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー</td><tD&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>シグマ</td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td>コプリン染色瓶</td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム緩衝剤</td><td></td><td></td><td> 10mMのクエン酸ナトリウム、0.05％ツイーン20、pH6.0の</td></tr><tr><td>パパニコロウペン</td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ</td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA） </td><td>フィッシャー</td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマ</td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファーを</td><td></td><td></td><td> 2％ヤギ血清、1％BSA、0.1％トリトンX-100、0.05％のTween20、0.05％ナトリウムアジ化ナトリウム、0.01MのPBS、pH7.2中、4でミックス＆℃で保存</td></tr><tr><td>抗体希釈バッファー</td><td></td><td></td><td> 0.1％トリトンX-100、0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、0.04％EDTAを</td></tr><tr><td> TIR用のブロッキングバッファー＆抗体希釈バッファー</td><td></td><td></td><td>上記のようにしますが、洗剤の添加（トリトンX-100、Tween 20）でなくても同じレシピ</td></tr><tr><td> DAPIでゴールド褪色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td>ベンチインキュベーションシェーカー</td><td> Barnsteadラボライン</td><td>マックスQ4000 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>パーキンエルマー</td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td>冷凍遠心器</td><td>ベックマン·コールター</td><td>微量22R</td><td></td></tr><tr><td>蒸し器</td><td>ブラック＆デッカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオImage.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

このプロトコルは、感染症や大腸炎の堅牢なモデルを生成するために必要な手順と同様に、マウスでシトロrodentium感染を特徴付けるために使用方法を概説します。C. rodentiumは密接に臨床的に重要なヒト病原体の病原性大腸菌に関連しているグラム陰性、マウスの特定の細菌性病原体である大腸菌と腸管出血性大腸菌大腸菌 。 Cと感染時にrodentium、免疫応答性マウスは、ささやかな、一時的な体重減少と下痢に苦しんでいます。組織学的には、腸陰窩の伸長、免疫細胞の浸潤、および杯細胞の枯渇が観察される。感染のクリアランスは3〜4週間後に達成される。感染後の異なる時点で腸上皮バリアの完全性、細菌負荷、および組織学的損傷の測定は、感染に感受性マウス系統の特性評価を可能にします。 病原性機構細菌の病原体は、そのホストの腸管を植民地と同様に、このような感染症から身を守る、特定のホストの応答が十分に理解されてs。したがってC.腸内細菌感染のrodentiumモデルは 、これらのプロセスの我々の理解を助けるための貴重なツールとして機能します。腸内細菌はまた、炎症性腸疾患（IBDs）にリンクされている。これは、IBD患者で見られる不適応な慢性炎症性応答が腸内細菌に腸の粘膜免疫系の異常な暴露後遺伝的に感受性の個人で開発したという仮説が立てられている。したがって、感染性大腸炎のモデルの研究では、腸内細菌への潜在的病原宿主応答を定義するための大きな可能性を提供しています。C. rodentium誘発性大腸炎は、IBDの病因の潜在的なメカニズムの理解を促進し、腸内細菌に対する宿主応答の解析が可能になり、そのような希少なモデルです。小説の予防や治療法の開発に欠かせない。

標準的な感染実験では、マウスは、100μlの一晩の強制経口投与によって、約2.5×10 8 CFUに感染しているrodentium文化 。 CとC57BL / 6マウスの感染ささやかな、一時的な体重減少と下痢でrodentium結果 。 C57BL / 6マウスを持つまれな出来事が、動物が病気になると安楽死が必要な場合があります。したがって、マウスは異なる株が感染症の影響を受けている程度を判?...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。

ザ<em&gt;シトロrodentium</em&gt;マウスモデル：感染性大腸炎に勉強病原体とホスト貢献

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K ビュー.  BC Children's Hospital. シトロrodentium感染は腸内細菌感染症を勉強するだけでなく、マウスでは免疫応答や大腸炎をホストするための貴重なモデルを提供します。このプロトコルは、障壁の完全性、病原体負荷と病原体と宿主マウス感染性大腸炎への貢献を徹底特性評価を可能にする組織学的損傷の測定の概要を説明します。

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

免疫・感染学

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

局所および全身所における病原体により誘導される慢性炎症のためのマウスモデル

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...