インペリアルカレッジにおけるin vivoイメージング施設で MRCによって資金を供給された。

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. 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Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. 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この記事への生産とフリーアクセスは、パーキンエルマーが主催しています。 著者はケビン·P、フランシス、ジェフMeganckとChaincy郭はキャリパー·パーキンエルマー社の従業員です。 全ての動物実験は、動物科学手続法1986に従って実施され、地元の倫理審査委員会によって承認された。

細菌感染の4D映画は、迅速かつ容易にマルチモダリティイメージング、大量のデータを視覚化し、解釈するための有用なツールを提供しています。この手法は、感染症は、個々のマウスを介して拡散し、縦断的研究7時にホストまたは細菌遺伝子または特定の介入戦略の効果細菌負荷、流通、ローカライズの方法削除を調査するために使用する方法の詳細な分析を容易にします。これらのビデオにも便利教材や国民に情報発信の手段を提供します。 DLIT-μCTイメージングと感染の4Dのビデオをコンパイルする機能から得られたデータの品質に影響を与える可能性があり、このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。このプロトコルの最も重要な部分は、C.を有するマウスの正常かつ均質な感染症であるrodentium。これは、研究のために使用されるマウスは18〜20グラムの間で、そのあることが不可欠であるbacteリアル接種は、新たに調製し、約5×10 9 cfuのは、前述2,3に記載されている。以前はマウスの感染に、それは接種はスペクトルCTを使って、一度接種が準備されている生物であることを確認することが重要であるそれぞれのマウスがマウスが同じような感染量を受け取ることを保証するために強制経口投与する前に、それが継続的に均質化されている必要があります。マウスのDLIT-μCTイメージングは​​リビングイメージ4.3.1ソフトウェアの自動露出機能が自動的にうまくノイズの上になるように信号用に最適化された撮像パラメータを決定するように最適化されています。ただし、自動露光機能が手順で説明したように変更する必要がユーザ設定及びパラメータに依存している。これを怠ると、自動露出のためのスペクトラムCTの工場出荷時の設定は、撮像腫瘍が発現するためにプログラムされると、感染の明らかな進行をもたらさないことを集めた光子の数が少ないと悪いイメージになりますホタルルシフェラーゼ。復元は、560から620 nmのシミュレートと測定データとの間の最良の合意を与える使用して実行し、そのため、復興に含めるより信頼性の高いデータである。 DLIT-μCTの使用に制限はμCTスキャンからの電離放射線は、縦断的研究18の累積である亜致死放射線損傷の原因となります。亜致死放射線露光は、DNA損傷、および内臓19におけるアポトーシスを引き起こす免疫応答を弱めることができる。電離放射線のためのLD 30分の50はマウスのマウス系統や年齢に応じて、5〜7 Gyの間で18,20,21を使用され、超過した場合に最終的に、累積致死放射線損傷は、死を引き起こす可能性があります。包括的な原則は、保守的に線量を推定することであるため、電離放射線の分子損傷のいくつかは、癒すことができますが、これは一般的に研究計画では占めていません。その代わりに、目的はずっとベルとして滞在することですできるだけOWはこれらの制限はまだ研究の目標を達成しながら。これは、感染に対する正常な免疫応答のこの研究において特に重要である、画像化、およびトランスジェニック動物を免疫構成され、又は頻繁に感染しているという事実の周波数は、電離放射線の影響をより受けやすいかもしれない。 感染の4Dムービーを生成する実験を計画するとき、それは実験の長さを考慮することが重要である、μCT数が使用されているマウス系統に対して電離放射線のために、この期間中に必要とLD 30分の50スキャンします。これは細菌の検出限界とイメージング時間に影響を与えるとしてDLIT-μCTに別の潜在的な制限は、使用されている菌株内レポーター発現の強さです。 BLIのために以前に実証されるようにこれは非常に、研究者が完全に病原性である菌株を検証し使用することをお勧めしますが、最大のルクスオペロンの発現のために最適化され2,3。 4Dイメージングの現在の設計の一つの注意点は、それぞれのムービーが異なる光子スケーリングを持つ個々のDLIT-μCTスキャンで構成されているということです。 BL病巣の局在、またはその強度に変化は微妙である場合、これは解釈が画像を困難にすることができたり、複数の弱巣に囲まれた1激しいBLフォーカスが存在する場合。したがって、長手方向の視覚化のために、それは時間ポイント間のカラーバーの一貫性を保つことが重要である。 感染の4D映画の概念は、任意の適切に標識された細菌性病原体に適用することができる。この技術の今後の展開は、感染に対する宿主応答を調査する赤外線プローブ近い蛍光生物発光細菌性病原体および注射の組み合わせを使用して、感染に対する宿主応答の調査を容易にするために、蛍光イメージング断層撮影（FLIT）ならびにDLITを使用することを目指します。さらにこれに、このプロトコルで我々だけ感染の4Dムービーを作成するための生物発光細菌の使用を記載している。しかし、いくつかの例では、生物発光レポーター、感染時にホスト遺伝子を調査するために使用することができるので、IRFPでタグ付けされ、例えば、蛍光標識された細菌を使用する必要があるかもしれない。重要なのは、DLIT / FLIT-μCTを組み合わせたマルチモダリティイメージングの使用は、私たちは非侵襲的に削減、洗練、および科学研究における動物の使用の交換に大きく貢献する細菌感染症、間に複数のパラメータを調べることができますNC3Rのイニシアチブ（に概説されているよう<a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ）。

特に小さな動物モデルは、これらのマウスを利用して、日常的に細菌の病原性を調査するために、又は抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよびワクチン1-7などの感染のために介入戦略をテストするために使用される。小動物の感染症からの主な実験的な読み出しは病原体負荷、感染症の空間的および時間的局在、および感染した生物の免疫応答への変更である生体内光学イメージングでは感染症研究のための貴重なツールであり、複数の監視に使用できますレポーター遺伝子を使用することにより実験的読み出し（ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、β-ラクタマーゼ、等）、蛍光色素、ナノ粒子またはタンパク質、生物学的プロセス、又は微生物6に標的化学発光プローブ。 生物発光イメージング（BLI）が病原性bacteにより、例えば、マウス、ラットなどの小動物のコロニー形成を監視するために使用される光学撮像モダリティであるRIA 3,6,8,9。マウスはそのようなPhotorhabdusのluminescensからルクス CDABEオペロンとしてルシフェラーゼを発現する組換え細菌に感染している。これらの細菌は、その後vivoイメージングシステム3,6,9 に基づいてCCDを使用して光生成を介して検出することができます。重要なのは、唯一の代謝的に活性な微生物は、生存細菌細胞は、この方法論10,11によって検出される、つまり生物発光（BL）である。 2D BLI使用して、BL源の位置は、信号が発せられる動物8の表面から推測される。 in vivoでの BL病巣の正確な解剖学的局在は対照的に、臓器3,6,9のex vivoでの分析によって決定されなければならない、合成3次元拡散光トモグラフィイメージング（DLIT）はBLの定量的な3次元再構成をコンパイルするために使用することができるソース12。 DLITが定義狭帯域通過光フィルタを用いて撮影したBL画像を収集することによって行われ、その後、拡散光トモグラフィー3次元再構成アルゴリズム1,7,12,13にそれらを入力する。 現在のところ、マルチモダリティイメージングはex vivoでの解析を必要とせずに、in vivoで生物発光病巣の真の非侵襲的な解剖学的局在を得ることができる唯一の方法論です。最近、我々はDLITプロバイオティクス細菌7と予防的治療後にシトロrodentium（C.rodentiumの ）植民地化の動態を評価するためにμCTイメージングと共同で登録された組み合わせを使用していました。C. rodentiumは病原性とenterhemorrhagic 大腸菌 14とモデル、人間の感染に使用されたマウス特有の腸病原体である。Cでrodentium感染は一般的に軽度の体重減少、下痢、偏Th1型免疫応答と結腸陰窩の過形成など、明確な病理学的変化、及び取り付け、控えめ病変のformatiに関連付けられている、大腸炎を引き起こす14。これに加えて、C. rodentiumの病因は、徹底的にこの細菌マルチモダリティイメージング3,4,7での使用に理想的なモデル微生物作り、十分に文書化されているC57BL/6JマウスにBLIとその植民地化のダイナミクスを使って研究されてきた。 このプロトコルは、単一のマルチモダリティイメージングプラットフォーム、IVISスペクトラムCT、および非侵襲的に、この感染症の真の力学的な関係を示すの4D映画の生成を使用して細菌感染の統合DLIT-μCTイメージングのための方法論を概説する最初のものです。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

このプロトコルは、縦方向に感染サイクルの4次元（4D）のムービーを生成するために統合されたμCT（DLIT-μCT）及びこのデータのその後の使用との複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた生物発光細菌感染を監視するために必要な手順の概要を説明します。 4D感染ムービーを開発し、IVISスペクトラムCTを用いた細菌感染症研究のためDLIT-μCTイメージングを検証するために、我々は生物発光C.感染を使用マウスで自己限定性大腸炎を引き起こすrodentium、。このプロトコルでは、生物発光C.によるマウスの感染を概説rodentium、毎日DLIT-μCTイメージングと8日間の糞便からの細菌の列挙によって植民地化の非侵襲モニタリング。 IVISスペクトラムCTの使用は、単一のイメージングプラットフォームを用いた光とμCTスキャンのシームレスな同時登録を容易にする。低用量μCTのモダリティは、マウスのイメージングを可能にする累積放射線からアーチファクトを引き起こすことなく、3Dで生物発光細菌の巣の詳細な解剖学的局在を提供する感染中の複数の時点、で。重要なのは、感染したマウスの4D映画がin vivoで細菌のコロニー形成のダイナミクスを監視するための強力な分析ツールを提供する。

5×10 9 cfuのC.とC57BL/6Jマウスの感染rodentiumはよく説明し、細菌感染モデルと自己限定胃腸感染の結果である日6-8感染後の間に3〜4週間2,14間続く ​​ピーク。感染症は、マウス免疫系によって腸管腔に限定されており、結果として、細菌が絶えず糞便中に流されている。 C.によるマウスの植民地化rodentiumは糞、または生物発光イメージング2,3から直接細菌の列挙によって非侵襲的に監視することができます。 本稿では、Cの 3Dと4Dのマルチモダリティイメージングを実行するための最適化されたプロトコルを概説感染中の細菌負荷およびローカリゼーションを監視するマウス内rodentium。 図1に示した結果が成功の4Dイメージングのために必要とされる制御を示す。それを阻止することが不可欠であるマウスの感染に先立ち使用される細菌の接種は、生物発光（ 図1A）であることを鉱山とその生物発光Cとマウスの強制経口投与後に信号は動物の胃の中ではなく、肺（ 図1B）16で観察できることrodentium、。 生物発光イメージングを使用して細菌のコロニー形成を監視することに加えて、それは糞便中の細菌数を定量化することをお勧めだ、胃腸粘膜の細菌定着の間接的な測定として使用される図2 8 C57BL6 / Jから取ら糞便中の典型的な細菌負荷を示しています。 〜5×10 9 CFU ICC180に感染し、約5×10 10 CFU / gであり、一日6-7どこで感染ピーク日まで2 PIから8日間のPI植民地の上昇のために監視されているマウス 以前の報告2,3,17に沿ったです。 評価の重要性を強調するにはティンシングルマウス、 図1b及び3と同様に、 ビデオ1での感染の広がりが C以下同じマウスから生成されています上述したようにrodentium感染 、。毎日DLIT-μCT、解剖学的基準としてスケルトンを使用して、このマウス内の生物発光細菌の空間分布を評価した。 図3は、少なくともPI 3キーの時点でICC180に感染したC57BL/6JマウスのDLIT-μCT再構成を示してい3日目PI小さな生物病巣は空間分布の変化が少ないと5日目PIによる生物発光強度の緩やかな増加を示す結腸で観察することができる。 7日目PIで私たちは生物発光の大幅な増加と結腸全体にわたる生物病巣の広がりを観察した。 ビデオ1日からICC180と1-8 PI 3D DLIT-μCT再建の集大成であり、Cを示しています日で細菌病巣は結腸全体をカバーする7 PIピーキングまで大腸内細菌の数字は拡大4-6 PI日から3日目のPIで大腸に広がる日1-2 PIの間に近位消化管内rodentium。 8日目PIのみで二つの異なる細菌の巣には、近位および遠位結腸に存在している。時系列順に各時点で完全な3D再構成を表示する機能は、ホスト病原体の相互作用を分析するための強力なツールを表し、同じデータセットの3D静止画より解釈が容​​易である。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> 図1の2次元生物発光イメージング）生物発光C. rodentium ICC180接種と接種200μlで強制経口投与後にB）マウス。アローヘッドは（&gt;）生物発光C.を示しrodentium </<html> em&gt;の胃である。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> 図2。C. rodentium植民ダイナミクス℃の定量8日間PIのため糞からrodentiumコロニー形成単位<img alt="図3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> 図3。生物発光Cの拡散光イメージングトモグラフィー-μCTスキャン3日目、5と7 PIアロー（&gt;） で監視1マウスからrodentium感染は結腸植民地化を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 ビデオ1。P :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;映像を表示するには、ここをクリックしてください。 日1から8までのPIを監視1マウスからC.rodentiumの感染の 4D映画

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4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説<em&gt;シトロバクターrodentium</em&gt;との4Dムービーを作成するためにμCTイメージングと複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた細菌のコロニー形成の長手方向の監視<em&gt; C. rodentium</em&gt;感染。

の4Dのマルチモダリティイメージング<em&gt;シトロバクターrodentium</emマウスにおける&gt;感染症

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K ビュー.  Imperial College London. マルチモダリティイメージングは​​、小さな動物モデルで細菌のコロニー形成を研究するための貴重なアプローチである。このプロトコルは、生物発光とマウスの感染症を概説シトロバクターrodentiumとの4Dムービーを作成するためにμCTイメージングと複合3D拡散光イメージングトモグラフィーを用いた細菌のコロニー形成の長手方向の監視