NSF（0854551）から研究助成を受けた。

1。予備実験の準備<ol><li> 1リットルのNFR（ノーマルカエルリンガー）、（b）は100ミリリットル10％食塩水、（c）は100ミリリットル、CMF（のCa 2 + / Mg 2 +を含まない溶液は、（）：次の解決策を（組成は表1を参照）を準備）、（d）は1ミリリットルのITS（インスリン - トランスフェリン - セレン、シグマI1884）、（e）は100ミリリットルのL-15培地、（f）は、10ミリリットルHCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピンシグマ、CG-10）、（g）は100アムホテリシンBのミリリットルK +内部 ​​溶液、（h）は100ミリリットルK +内部 ​​溶液溶液1の浸透力は、それが蒸気圧浸透圧計（ 例えば Wescorモデル＃5100C）を用いて約260 mOsMであることを保証するためにチェックする必要があります。 </li><li> （b）のソリューションを殺菌フィルター処理、および（c）。ソリューションズ（a）と（b）と（c）は4℃で3ヶ月まで保存することができます25ゲージの注射針とシリンジフィルターを介して凍結乾燥粉末を含むバイアルに1 ml脱イオンH 2 Oを追加することにより、溶液（d）を準備します。この最終的な解決C30日間4℃で保存すること。 </li><li>ビーカーやフラスコ内のすべてのコンポーネントを組み合わせることにより、層流フード内の溶液（e）を準備します。最終的な解決策を滅菌し、滅菌遠心管に10ミリリットルのアリコートを転送フィルタします。 -20℃で保存する。 </li><li> 25ゲージの注射針とシリンジフィルターを介して凍結乾燥粉末を含むバイアルにH 2 Oを脱イオン10ミリリットルを添加することによりHCG（溶液（f））を準備します。この最終的な解決策は30日に4℃で保存することができます。 </li><li> Minutienピン（26002から10、ファイン科学ツール）は、シアノアクリレート接着剤でガラスパスツールピペットの最後に接着することによって、少なくとも2顕微解剖ツールを製作してください。ピペット約0.5cmの末尾を超えて拡張するためにピンの鋭い端を許可します。 </li><li>二日間の文化を準備する前に、以下の手順で繁殖を誘発する。平面のsuに女性と暗い色素沈着に著名な、赤みを帯びた総排泄腔を観察することにより、 アフリカツメガエルの飼育対応のペアを識別雄の前足のrface。時間、正味各カエルに1つ、それは逃げることができないようにネットでシンクに腹側にそれを押したままにします。背側リンパ嚢の1に皮下ネットと通じ溶液1ml（f）を注入します。 </li><li>水の覆われた10ガロンタンクで一緒に繁殖のペアを置きます。動物が新たにレイアウトされ、受精卵を踏みつけないようにするため、およそのメッシュサイズ½タンクの底部（ 図1A）上記の&quot;取り付けは約1〜2インチでスクリーニングされた床をインストールしてください。 </li><li>動物が抱接にあり、受精卵が画面下の床（ 図1B）に観察されるまで、12から48時間静置カエルのままにしておきます。 </li><li>タンクから動物を削除しますが、長く、少なくとも24時間、卵はそのままにする。カエルのこのペアは、6週間後に再飼育することができます。 </li><li>タンクの底部から胚を緩めて、4または5 60x15 mmのカルトに転送10％食塩水（溶液B）を含有するURE皿。 Niewkoopとフェーバー（文献20）のスキームに従って段階で胚をソートします。有用胚はステージ22から24でそれらになります。 図2A、図2B（約28段）に有用であることが開発に沿って遠すぎる胚を示しながら、約22段階の胚を示しています。それは健康である胚を選択することが重要です：明るい茶色と白のまだらのある外観が滑らかなものが理想的です。大きな黒または白のパッチが適用されている胚は一般的に不健康と使用できなくなります。 </li></ol> 2。 アフリカツメガエル胚の顕微解剖<ol><li>層流フード、ラベル内、10％食塩水で中途半端に約3 60x15ミリメートル無菌培養皿を満たし、およびCMFと1。 </li><li> 10％の食塩水を含んだ料理の一つに、滅菌したガラスパスツールピペット転送五から十段22から24胚を用いた。ステレオズームの助けを借りて解剖するフード内側る顕微鏡（10×接眼レンズ0.6-5X）は、無菌の＃5鉗子（11251から30、ファイン科学ツール）の2ペアを使用して、それぞれの胚からゼリーコートと卵黄膜を除去します。 （ 図3Aおよび図3Bを参照してください。） </li><li> CMFを含む皿にようやく生理食塩水と10％の残りの2つの料理を通じて、一つずつそれらを渡すことによって、裸の胚を洗浄します。各転送のための新しい、滅菌ピペットを使用し、皿から皿に移し、溶液の体積を最小限に抑えます。 </li><li>ターンでは、ステップ1.5で作ら顕微解剖ツールを使用して、ピンセットで優しく、しかし、しっかりとそれぞれの胚を保持し、神経管や動物の中で最も背側面に配置されている関連した筋節を削除します。 3スライス、神経管の場所と、それ（ 図4A）にちょうど腹第三のいずれかの端に1つにすることによってこれを行います。離れて卵黄granulから皿のきれいな部分に各解剖神経管/筋節を移動ESおよび他の残骸（ 図4B）。背腹軸、および神経管と筋節の位置は図4に示されている。 </li><li>この溶液中の約15分後（CMF）の解剖組織および廃棄の自由色素沈着した皮膚を持ち上げるためにピンセットを使用しています。彼らは互いに（ 図4C）から解離になるその他の30〜60分後、細胞は&quot;砂杭&quot;を形成することになる。 </li></ol> 3。神経筋共培養の準備<ol><li>培地を10 mlチューブを解凍し、無菌的にITSの70μlを添加し、35 ng / mlのBDNF（シグマB3795）。 </li><li>ラベルおよび滅菌35mm培養皿（FD35-100世界の精密機器）のほぼ中間のL-15培地（溶液（e））は、解剖し、各胚のための1とを埋める。 </li><li>炎の上にテーパ部を保持している間にガラスパスツールピペットの両端をつかんでメッキピペットを作製します。約1に端を引き離す次いで、0センチメートルと約0.2mmの先端を得るためにエンドを断つ。 </li><li>描かれた溶液の量を最小限に抑える1つの胚から &quot;砂杭&quot;を吸い上げるメッキピペットを使用しています。培養皿の底に細胞を追い出す。いくつかの行に分割プレートの細胞を。メッキされた未分化細胞（ 図5Aおよび5B）に従ってください。 </li><li>細胞は時間が皿にアタッチできるように、少なくとも15分間静置播種した細胞の料理にしておきます。 </li></ol> 4。パッチクランプ神経筋シナプス<ol><li>筋細胞は紡錘形となり、脊髄神経細胞は長い突起（ 図6）を拡張：培養液中で12から24時間後、播種した細胞は、異なる形態的特徴にかかる。神経突起varicositiesと筋細胞間の機能的なシナプスの接触が同時対に電気生理学的記録で確認することができます。 &quot;M&quot;、 &quot;S&quot;と &quot;V&quot;は神経、筋細胞にそれぞれ参照してください。ソーマとシナプス前静脈瘤。 </li><li>シナプス前静脈瘤のためのものと筋細胞のための1：録音のための2つのパッチ電極を準備します。 </li><li>シナプス前の電極については、次のようにアムホテリシン含有溶液を調製：5 mgのアムホテリシンB（シグマA4888）を含む1.5 mlマイクロチューブに100μlのDMSOを追加します。 10秒間ボルテックスこのソリューション。次に、アムホテリシンB（溶液（H））のために625μlのK +内部 ​​溶液を含む第二のマイクロ遠心チューブにこの溶液10μlを添加する。上記のように渦。 </li><li>ステップ4.3で調製したアンホテリシン含有のK +内部 ​​溶液とK +内部 ​​液（溶液（グラム））とシナプス電極を使ったプレシナプス電極を埋める。 </li><li> NFRと培養皿の中でメディアを交換して、位相差光学系を搭載倒立顕微鏡に変える。 </li><li>ただ、それぞれの対象の上に両方の電極を配置します。細胞全体の協力を得る静脈瘤電極を備えた穿孔パッチ設定の前筋細胞電極とnfiguration。 </li><li>シナプスの機能を確認するには、ソフトウェア制御の下で（ 例えば Axopatch 200B、Molecular Devices）をパッチクランプアンプで静脈瘤を脱分極（pCLAMP 9、Molecular Devices社など ）と同時シナプス前とシナプス後電流を観察します。 図7を見電流を示し+40 mVへ-30 mVから10 mV刻みでシナプス前静脈瘤に与えられる電圧のステップを脱分極への返信です。シナプス前細胞に見られる内向き電流は、Na ​​+とCa 2 +とK +による外向き電流によって運ばれる。シナプス後細胞に記録電流が静脈瘤から放出された神経伝達物質への応答であるとニコチン性アセチルコリン受容体チャネルを介したNa +が主に行われている。 </li></ol>

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	<li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse.">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641 (1976).</li><li>Weldon, P. R., Cohen, M. 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特別な利害関係は宣言されません。

運動ニューロンと筋細胞の共培養に成功における重要なステップは、適切にアフリカツメガエルカエルの誘発育種から生産胚を上演したの使用、および未分化脊髄ニューロンと筋芽細胞の注意深い無菌解剖されています。早く頻繁に彼らの開発、それらを停止して動くように、彼らは約10かそこらをステージに移動するまで、受精卵はそのままにすべきである。健康な胚は、滑らかな外観と茶色と白のまだらのカラーリングで識別されます。これは筋細胞が大幅に分化しただけで神経管が閉じた後と前に開発中のポイントであるため、ステージ22から24まで胚が最も有用である。また、古い胚から細胞がCMFによく解離することができない。それは、胚に強く付着したとして卵黄膜を除去するときは注意が必要です。胚はそのまま出てくるように、膜は鋭利なピンセットを用いてバラバラにされるべきである。もう一つの重要なprecautionは慎重に培養皿（むしろ彼らはそこに定住させるより）の底部にセルを配置することです。これは、細胞が培養皿に付着する可能性を高めるため、この方法をお勧めします。 神経と筋肉の間の機能的な神経伝達は、シナプス後の記録だけで決定することができると頻繁に神経支配の後に自発筋収縮の観察により確認することができる。非神経支配筋細胞は、培養中にけいれんはありません。単独でシナプス後録音が誘発放出のミニチュア終板電流または電位が、測定値を記録するために有用であるシナプス前の刺激を必要とし、前と​​シナプス後電流の相関がダブルパッチクランプが必要になります。 ペアになって、パッチの記録方法はここで説明する以外にも、この準備は、これが活動電位のthaの生成を可能にする神経細胞体5で3ピペットを紹介する機会を提供していますtは、シナプス前静脈瘤に伝播し、神経伝達物質の放出につながることができます。また、媒介すると考えられ、またはシナプス伝達を調節アール推定剤はシナプスのどちらかの側に導入することができる：筋細胞のピペットを介して、またはソーマに配置第三ピペットからの拡散による。

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器/用品 </td><td> ベンダー </td><td> カタログ/モデル番号 </td><td></td></tr><tr><td>インスリン - トランスフェリン - セレン</td><td>シグマ</td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>シグマ</td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td>蒸気圧浸透圧計</td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutienピン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から10 </td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td>シグマ</td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション名 </td><td> レシピ </td></tr><tr><td> （a）はNFR（ノーマルカエルリンガー（mMで） </td><td> 116のNaCl、2のKCl、1.8のCaCl 2、5のNa + - HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （b）は10％の食塩水</td><td> 10ミリリットル90ミリリットルNFRは、H 2 Oを脱イオン</td></tr><tr><td> （C）CMF（Ca 2 +の / Mg 2 +を含まない溶液） </td><td> 125のNaCl、2のKCl、1.2 EDTA、5mM Na +非 HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （e）は、L-15文化メディア</td><td> 50ミリリットルのL-15培地（シグマL1518）+ 50mlのNFR。 </td></tr><tr><td> （G）K +内部 ​​液（mMで） </td><td> 116のKCl、1のNaCl、1mMのMgCl 2、10 EGTA 5、HEPES、pH7.3の</td></tr><tr><td>アムホテリシンBの（h）のK +内部 ​​液（mMで） </td><td> 52 K 2 SO 4、38のKCl、1 EGTA、5 HEPES、pH7.3の</td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> TABLE 1。

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

神経伝達物質の放出を伴うシナプス前のイオン電流の結合に関する多くの情報が特に無脊椎動物の調製物、イカの巨大シナプス1から得られたものである。しかし、ここで説明する準備を除いて、いくつかの脊椎動物の調製品は、それが神経伝達物質の放出とシナプス前イオン電流の同時測定を行うことが可能であるが存在する。まで（数日間、彼らは一二から二四時間以内に機能シナプスを形成し、神経や筋肉の細胞の発達とシナプス相互作用を研究するために使用することができる;胚Xenopusの運動ニューロンと筋細胞は室温でシンプルな培地で一緒に成長させることができる異常増殖）が発生します。他の脊椎動物の調製品を介してこれらの共培養の利点をいくつか準備を簡単にするために、室温での文化や仕事を維持する能力、および2が形成されたシナプスの準備アクセシビリティを含める-4。準備がシナプス前のイオンチャネルと伝達物質放出5-8の規制の生物物理学的特性を研究するために広く用いられている。また、準備9-12神経突起伸長やシナプスの研究、神経伝達物質放出13-15、神経調節16,17の拡散性メッセンジャーの役割の分子機構、 および in vitroシナプス可塑性における 18を含む他の用途にそれ自身を貸している- 19。

図4Bは、すぐにステージ22 アフリカツメガエル胚からの除去後に孤立した脊髄/筋節の背側のビューを示しています。 図4Cは 、そののCa 2の皮膚の除去およびインキュベーション後の+-Mg 2 +を含まない溶液（CMF、溶液（示していますc））は、細胞が &quot;砂杭&quot;に解離するとメッキの準備ができている。直ちに培地細胞へのめっき後の少しの形態学的変動を（ 図5B）を示すが、文化の中で二十四時間後に異なる形状を取る。ニューロンは筋細胞（ 図6）シナプスで精巧varicositesという神経突起を延長しながら、球形のまま筋細胞は紡錘形になる。シナプス前とシナプス後静脈瘤筋細胞（ 図7）からの同時ペアリングパッチ記録は神経伝達物質の放出とresultaに関連付けられているシナプス前の内側と外向き電流を明らかにntのシナプス後電流を興奮。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：画面の上にバケツを交配することで、カエルの繁殖ペアB：受精卵と抱接中の蛙。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="図2"/> &quot;適切な&quot;ステージ22胚B：2図 。 &quot;不向き&quot;ステージ28胚。スケールバーは1ミリメートルを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="図3"/> 図3：ステージ22胚卵黄膜とゼリーコートの除去前。矢印はゼリーコートの外縁を指しています。卵黄膜はembrに密着。ヨーヨーと事実上見えませんB：ベア胚。スケールバーは1ミリメートルを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="図4"/> 図4：解剖部分-であることを示す破線でステージ22胚B：胚の急性単離した背部分と、 &quot;d&quot;と&quot;v&quot;は胚の背側と腹側の側面を参照して、 &quot;m&quot;の間。 &quot;n&quot;はmytomesと神経管のおおよその位置を示し、Cは：CMFで60分後の細胞の&quot;砂杭&quot;。スケールバーは1ミリメートルのために、AとBとCの0.5ミリメートルを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="図5"/> 図5：直ちにめっき後の培養中の細胞の5倍の電力を表示します。 B：40倍速で同じ文化。スケールバーは40μmのため、AとBは5μmを表す<img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="図6"/> 図6神経ソーマ（S）は、シナプス前静脈瘤（V）、およびシナプス後筋細胞（M）の同定と培養における神経筋接合部。スケールバー：5μmである。 <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="図7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> 図7：シナプス前（上）と、-30 mVから+40 mVへのシナプス前静脈瘤に提示10mVの増分電圧ステップのアプリケーションに応じて、見（下）シナプス後電流。電圧ステップはシナプス前のトレースの一部の隣に表示されます。両方の細胞のための保持電位は-70 mVであった。

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Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

このビデオでは、胚の初代培養を成長させるために使用する手順を示しています<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経や筋肉細胞と同時プリおよびポストシナプスのパッチクランプ記録を作るための本製剤の有用性。

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経筋共培養

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

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Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.8K ビュー.  David Geffen School of Medicine at UCLA. このビデオでは、胚の初代培養を成長させるために使用する手順を示していますアフリカツメガエル神経や筋肉細胞と同時プリおよびポストシナプスのパッチクランプ記録を作るための本製剤の有用性。

ビデオ: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

神経科学

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

神経電位電極の体系的電気化学的および電気生理学的評価方法

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

から電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Labellar味感覚器

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Methods Article

からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録